今天小編給大家講解一下細(xì)胞傳代培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)過程：
首先將新鮮培養(yǎng)基置于37℃電熱恒溫水浴鍋中回溫,，回溫后噴以75%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺(tái)內(nèi),。如配置：50mL*培養(yǎng)基(含10%FBS,，1%青鏈霉素雙抗)44.5mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 5mL FBS + 0.5mL青鏈霉素雙抗。戴防護(hù)手套后,，自液氮罐中取出冷凍管,，檢查蓋子是否旋緊，立即放入37℃水槽中快速解凍（避免冰晶重新結(jié)晶而造成細(xì)胞死亡）,，輕搖冷凍管使其在2分鐘內(nèi)全部融化,，以75%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺(tái)內(nèi),。
然后將解凍的1mL細(xì)胞懸液緩緩加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),，再向瓶中加入10mL*培養(yǎng)基(稀釋比例為1:10)，混合均勻,，放入37℃,，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取0.1ml解凍細(xì)胞懸液作存活測(cè)試,。(Sf9細(xì)胞在27℃生長(zhǎng),，可不需CO2) 。 一般而言,，細(xì)胞大都不需立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO),。若要立即去除,，則將解凍的細(xì)胞懸液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1300rpm,，5分鐘,，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基,，混合均勻,，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。若不需立即去除冷凍保存劑,，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基,。
37℃恒溫培養(yǎng)約48小時(shí)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80-90%后,，從培養(yǎng)箱取出75cm2培養(yǎng)瓶,，倒掉培養(yǎng)基。加入5mLPBS緩沖液吹打以洗去殘留血清,，倒掉緩沖液,。沿壁（無細(xì)胞的一面）緩緩加入1mL胰酶溶液消化細(xì)胞約1min，輕輕搖晃,，倒掉殘余胰酶,，將培養(yǎng)瓶置于恒溫箱中約1min，拿出培養(yǎng)瓶輕輕拍打一下細(xì)胞貼壁的一面,。
注意：消化溫度是37℃,，加液后用移液管反復(fù)吹打分散細(xì)胞。
向瓶中加入5mL*培養(yǎng)基,，反復(fù)吹打均勻2min,，從中取出20μl至0.5ml小離心管中，向管中加入80μl臺(tái)盼藍(lán)溶液,，混勻,，從混合液中取出10μl至蓋好蓋玻片的計(jì)數(shù)板上，計(jì)算細(xì)胞密度及活率,。將5mL細(xì)胞懸液全部吸出,，分別接種1mL懸液到原培養(yǎng)瓶和另一新的培養(yǎng)瓶中，其余舍棄,。再向兩瓶中各加入10mL*培養(yǎng)基,，置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（細(xì)胞傳代時(shí)按1：5或更大比例稀釋）
細(xì)胞凍存：
1. 冷凍前確保細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期,，傳代后的5mL細(xì)胞懸液取出1mL接種到培養(yǎng)瓶繼續(xù)傳代,。另取一無菌離心管，將剩余4mL細(xì)胞懸液置于其中,，離心1000rpm,，5min（轉(zhuǎn)速勿超過1500rpm）,。
2. 離心后倒掉上層清液，收集下層細(xì)胞沉淀,。向離心管中加入900ul*培養(yǎng)基,，用槍頭反復(fù)吹打重懸起細(xì)胞。取少量細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率,。一般細(xì)胞濃度為2~5×106cells/ml較適宜,。
3. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入1.5mL無菌凍存管中，再加入100ul試劑級(jí)DMSO,，混勻,，制成細(xì)胞凍存懸液（DMSO后濃度為10％）。嚴(yán)密封口后,，注明細(xì)胞名稱,、代數(shù)、日期,，然后進(jìn)行凍存,。
注意：對(duì)Sf9細(xì)胞而言，凍存比例為：95%培養(yǎng)液+5%DMSO,。
4. 傳統(tǒng)方法：冷存管置于4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16~18小時(shí)（隔夜）→液氮罐長(zhǎng)期儲(chǔ)存。（-20℃勿超過1小時(shí),，防止胞內(nèi)冰晶過大造成細(xì)胞死亡）
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