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間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）具有多向分化的潛能,，在體外一定條件下可以誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞,、成軟骨細(xì)胞,。

如何做好干細(xì)胞誘導(dǎo)分化？

成骨

1. 接種hMSC：用MSC Attachment solution 預(yù)包被24孔盤,，每孔加入0.5ml MSC NutriStem® XF,，接種6x104細(xì)胞 (3x104cells/Cm2)。

（注意：若使用其他培養(yǎng)器皿,，請(qǐng)適當(dāng)調(diào)整體積,。)

2. 置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

3. 分化：培養(yǎng)24h后即細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí),，將MSC NutriStem® XF 培養(yǎng)基吸除,，每孔加入0.5ml分化培養(yǎng)基。

（注意：若細(xì)胞融合度<80%,，繼續(xù)再培養(yǎng)一天,。）

4. 置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-21天,，每2-3天換液,。

（注意：培養(yǎng)時(shí)間越長，越容易礦化,，ARS染色更明顯,。）

5. 成骨評(píng)價(jià)：使用2%的ARS染色液。

成脂

接種hMSC

1. 用MSC Attachment solution 預(yù)包被24孔盤,，每孔加入0.5ml MSC NutriStem® XF,，接種6x104 細(xì)胞 (3x104 cells/cm2)。注意：若使用其他培養(yǎng)器皿,，請(qǐng)適當(dāng)調(diào)整體積,。

2. 置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

分化

1. 培養(yǎng)24h后即細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時(shí),，將MSC NutriStem® XF 培養(yǎng)基吸除，每孔加入0.5ml分化培養(yǎng)基,。

注意：若細(xì)胞融合度<80%,，繼續(xù)再培養(yǎng)一天。

2. 置于37°C,，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14-21天,，參照以下建議的替代培養(yǎng)基。

根據(jù)hMSC類型的替代培養(yǎng)基方法

不同來源的hMSC具有不同的多向分化潛能,。例如,，hMSC-AT需要較短的誘導(dǎo)期(~ 6天)，而比hMSC-BM和hMSC-CT需要10天誘導(dǎo)期,。

注意：對(duì)于所有不同類型的hMSC,，誘導(dǎo)成脂后建議使用維持培養(yǎng)基。避免將液體直接加入到脂肪細(xì)胞上,，需要非常小心移液,，因?yàn)橹炯?xì)胞是脆弱的。

hMSC-AT:

一個(gè)分化周期/維持培養(yǎng)基

6-8天使用*成脂分化培養(yǎng)基,，建議每3-4天換液。

成脂誘導(dǎo)完成后,，用維持培養(yǎng)基MSC NutriStem® XF替代分化培養(yǎng)基,，培養(yǎng)3-4天,。

hMSC-BM:

一個(gè)分化周期/維持培養(yǎng)基

8-12天使用*成脂分化培養(yǎng)基，建議每3-4天換液(0.5 ml/well),。

成脂誘導(dǎo)完成后,，用維持培養(yǎng)基(MSC NutriStem® XF替代分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)3-4天,。

hMSC-CT:

至少兩個(gè)分化周期/維持培養(yǎng)基

5-10天使用*成脂分化培養(yǎng)基,，建議每3-4天換液(0.5 ml/well)。

成脂誘導(dǎo)完成后,，用維持培養(yǎng)基替代分化培養(yǎng)基,，培養(yǎng)3-6天，每2-4天換液,。

重復(fù)培養(yǎng)周期直到觀測到成熟脂肪細(xì)胞（即脂滴的形成）,。

成軟骨

1. 接種hMSC，3D培養(yǎng)在 96-well U-bottom培養(yǎng)板中每孔加入100μl MSC NutriStem® XF,，接種1x105細(xì)胞 (30-40x104 cells/cm2),。無需預(yù)包被。

注意：微量培養(yǎng)技術(shù)也是一個(gè)選擇并且可以激發(fā)球形細(xì)胞的形成：接種10μl 1x104cells/ml 入板的中心（MAX終1x105cells/well）,，使其貼壁2小時(shí),，然后加入培養(yǎng)基0.1ml/well。

2. 置于37°C,，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。在24-48小時(shí)內(nèi)會(huì)自發(fā)形成球狀體。

3. 分化：培養(yǎng)24小時(shí)后,，將MSC NutriStem® XF培養(yǎng)基吸除,，每孔加入0.2ml分化培養(yǎng)基。

4. 置于37°C,，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14-21天,。

注意：培養(yǎng)時(shí)間長，將得到更成熟的軟骨細(xì)胞（Alcian Blue染色強(qiáng)度更大）,。

5. 每3-4天更換分化培養(yǎng)基（0.2ml/well）,。

注意：小心不要吸入球狀體。

以上設(shè)備詳情,，請(qǐng)咨詢上海喆圖儀器廠