今日喆圖小編教大家如何提取質(zhì)粒DNA的實(shí)驗(yàn),,相關(guān)設(shè)備:恒溫培養(yǎng)箱,、恒溫水浴鍋,、真空干燥箱
實(shí)驗(yàn)方法原理
堿裂解法是基于DNA的變性與復(fù)性差異而達(dá)到分離目的的,。堿性使質(zhì)粒DNA變性,再將pH值調(diào)至中性使其復(fù)性,,復(fù)性的為質(zhì)粒DNA,,而染色體DNA不會(huì)復(fù)性,纏結(jié)成網(wǎng)狀物質(zhì),,通過(guò)離心除去,。
實(shí)驗(yàn)材料
大腸桿菌
試劑、試劑盒 Tris-HclEDTA葡萄糖NaOHKAacNaAc異丙醇溶菌酶酚:Cl仿無(wú)水乙醇LB培養(yǎng)基
儀器,、耗材 超凈工作臺(tái),、恒溫培養(yǎng)箱、搖床,、恒溫水浴鍋,、臺(tái)式離心機(jī)取液器、低溫冰箱冷凍,、真空干燥機(jī),、電泳儀水平電泳槽、紫外觀測(cè)儀
實(shí)驗(yàn)步驟 一,、材料與試劑準(zhǔn)備
1. 材料:大腸桿菌,。
2. 儀器:超凈工作臺(tái),恒溫培養(yǎng)箱,搖床,,恒溫水浴鍋,,臺(tái)式離心機(jī),取液器一套,,低溫冰箱,,冷凍真空干燥機(jī),電泳儀,,水平電泳槽,,紫外觀測(cè)儀。
3. 試劑:(1)Solution I :25 mM Tris-Hcl(pH7.4),,10 mM EDTA(pH8.0),50 mM葡萄糖,,高壓滅菌,,4℃保存。(2)Solution II :0.2 M NaOH,, 1%SDS 現(xiàn)配現(xiàn)用,。(3)Solution III :5 N KAc pH4.8,高壓滅菌,,4℃保存。(4)3 M NaAc pH5.2,,高壓滅菌,,
4℃保存。(5)異丙醇,,溶菌酶(8 mg/ml),,酚/Cl仿,無(wú)水乙醇,,70%乙醇,LB培養(yǎng)基,,電泳試劑,。
二、操作步驟
1. 細(xì)菌繁殖:LB培養(yǎng)基,,2 ml/20 ml,,37℃,200 rpm,,搖一搖,,過(guò)夜。
2. 離心10 min,,5 000 rpm,, 4℃;棄上淸液,。
3. 沉淀(菌體細(xì)胞)預(yù)冷的TES緩沖液洗滌,,離心10 min,5 000 rpm,, 4℃,,加入預(yù)冷的1 ml Solution I,冰浴10 min,。
4. 重新懸浮,,加入150 ul溶菌酶母液,,室溫放置5 min,。
5. 加入1.2 ml Solution II, 冰浴5 min,。
6. 加入0.9 ml預(yù)冷乙酸鉀,混勻,,離心10 min,,12 000 rpm,4℃,。
7. 加入1.5 ml異丙醇,,-20℃冰箱內(nèi)放置15 min。
8. 離心10 min,,12 000 rpm,,4℃。
9. 取沉淀,,懸于400 ul TE緩沖液中,。
10. 加入40 ul,3 M NaAc,。
11. 酚/Cl仿,,抽提,乙醇沉淀,。
12. 離心10 min,,12 000 rpm,4℃,。
13. 取沉淀,,冷凍干燥,,再懸浮于50 ul TE緩沖液中。
14. 電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量,。
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