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    電熱恒溫培養(yǎng)箱采用電熱膜加熱方式,，在箱體與內(nèi)膽之間安裝電熱膜，使用熱傳遞方式加熱,，加熱速度快,。多應(yīng)用于實驗室的各種細(xì)胞菌類的培養(yǎng),，今天要說的是大腸桿菌，下面喆圖小編講一些操作流程供大家參考一下,。

    細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（電擊法,、CaCl2法）等處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,，成為能允許外源DNA分子進入的細(xì)胞,，即感受態(tài)細(xì)胞（Compenent cells）。

實驗方法原理：

   帶有外源DNA 的重組質(zhì)粒,，在體外構(gòu)建后,，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，隨著細(xì)胞的大量復(fù)制,、繁殖,，才能夠有機會獲得純的重組質(zhì)粒DNA，該過程稱之為轉(zhuǎn)化過程,。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2,，RuCl 等化學(xué)試劑）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化,，能容許外源DNA 的載體分子通過,。

實驗材料：

E. coli DH5α菌株

 試劑、試劑盒：LB固體培養(yǎng)基,、LB液體培養(yǎng)基,、CaCl2、硫酸鎂,、SOB,、TFB

    儀器、耗材：培養(yǎng)皿,、恒溫?fù)u床,、聚丙烯管、電熱恒溫培養(yǎng)箱,、臺式高速離心機,、無菌工作臺、燒瓶,、恒溫水浴鍋,、低溫冰箱、制冰機,、分光光度計,、微量移液槍、錐形瓶,、試管

實驗步驟：

1,、從37℃培養(yǎng)16-20 h的平板中挑取一個單菌落(直徑2-3 mm),，轉(zhuǎn)到一個含有100 ml LB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)3 h,。一般經(jīng)驗,，1 OD600約含有大腸桿菌DH5α 109 個/mL。

2,、將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個無菌,、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50 ml聚丙烯管中,，在冰上放置10 min,，培養(yǎng)物冷卻至0℃。

3,、于4℃用Sorvall GS3特頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以4 100 r/min離心10 min,，以回收細(xì)胞。

4,、倒出培養(yǎng)液,，將管倒置1 min以使后的痕量培養(yǎng)液流盡。

5,、每50 ml初始培養(yǎng)液用30 ml預(yù)冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,，20 mmol/L CaCl2)重懸每份細(xì)胞沉淀。

6,、于4℃用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以41 00 r/min離心10 min,，以回收細(xì)胞。

7,、倒出培養(yǎng)液,，將管倒置1min以使后的痕量培養(yǎng)液流盡。

8,、每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2(或TFB)重懸每份細(xì)胞沉淀,。

9、此時,，可以用新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞直接做轉(zhuǎn)化實驗,，也可以將細(xì)胞凍存于-70℃,。

注意事項：

1.為達到轉(zhuǎn)化,，活細(xì)胞數(shù)務(wù)必少于108個細(xì)胞/mL，對于大多散大腸桿菌來說,，這相當(dāng)于OD值為0.4左右,。為保證細(xì)菌培養(yǎng)物的生長密度不致過高，可每隔15-20min測定OD600值來監(jiān)測,，用監(jiān)測的時間及OD值列一個圖表,，以便預(yù)測培養(yǎng)物的OD600值到0.4的時 間,，當(dāng)OD600值達到0.35時，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物,。

 2.在菌株與菌株之間,，OD值與每毫升中活細(xì)胞散間的關(guān)系變化很大，因此有必要通過漶量特定腦桿菌的生長培養(yǎng)物在生長周期的不同時相的OD600值,，并將各稀釋維度的培養(yǎng)物鋪于無抗生素的LB瓊脂板以計算每一時相的活細(xì)胞散,，從而使分光光度計讀數(shù)得到標(biāo)準(zhǔn)化。

3.對大多數(shù)大腸桿菌（MC106除外）,，采用TFB代替CaCl2可得到相同或更好的結(jié)果,。Dagert和Ehrlieh的實驗(1979)曾表明，細(xì)胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48 h,，在貯存的初12-24 h內(nèi),，轉(zhuǎn)化率增加4-6倍，然后降低到初始水平,。

4.克隆的新鮮程度,，一定要選新鮮平板的單克隆，即剛涂布生長過夜的平板,。

5.菌體的OD600值,，JM109或BL21，OD值為0.35,，DH5α為0.4,，要盡量保證OD值不要過高，更不能超過0.6,。

6.低溫處理的時間,，做完后冰上保存12-24h后分裝，并保存于-80℃,。

7.試劑和用品,，所有的用品（離心管、藥瓶等）用新的,，如果使用舊的,，要確保干凈，CaCl2溶液,。