化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
不同品牌游離核酸保存管的比較
閱讀：3302 發(fā)布時(shí)間：2020-8-171.前言
循環(huán)游離核酸(circulating cell-free nucleic acids)是指存在于人體循環(huán)系統(tǒng)中,，游離于細(xì)胞外的微量?jī)?nèi)源性或外源性核酸片段,，包括核DNA、線(xiàn)粒體DNA(mitochondrial DNA,，mitDNA),、病毒DNA、信使RNA(messenger RNA,，mRNA)及微小RNA(microRNA,，miRNA)等,。1948年,，Mandel等［1］*發(fā)現(xiàn)了血液循環(huán)中游離DNA的存在。隨后,，循環(huán)游離核酸在病理狀態(tài)下的特異性變化引起了廣泛關(guān)注,。雖然這一發(fā)現(xiàn)十分重大，但當(dāng)時(shí)并未引起人們的廣泛關(guān)注，并且在此后的很長(zhǎng)一段時(shí)間里,，人們也僅局限于研究游離 DNA 與人類(lèi)自身免疫病之間的關(guān)系,。1975 年，Steinman 在健康人的血漿中也發(fā)現(xiàn)有游離形式的核酸存在,，這提示我們這種核酸的出現(xiàn)屬于病理學(xué)事件,，而非病因?qū)W事件，但健康人血漿中游離 DNA 的量要顯著低于患有一定疾病的人,。1977年,，Leon等［2］發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中的游離DNA水平較健康人群明顯升高，并與腫瘤的進(jìn)展與預(yù)后相關(guān),。1997年,，人們發(fā)現(xiàn)在孕婦血漿中含有游離形式的胎兒源的 DNA，這使得血漿游離核酸的研究在胎兒出生前診斷方面的應(yīng)用也有了快速的發(fā)展,。1989年,，Stroun等［3］發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血液中的游離核酸含有與腫瘤細(xì)胞相同的基因突變。現(xiàn)如今,，游離核酸與腫瘤,、妊娠相關(guān)性疾病、自身免疫病,、移植排斥反應(yīng),、創(chuàng)傷、急救醫(yī)學(xué)等有著密切關(guān)系,，其檢測(cè)對(duì)疾病的早期診斷,、分期、監(jiān)測(cè),、預(yù)后判斷等有重要意義,。
鑒于游離核酸的重要檢測(cè)意義，游離核酸的保存條件則直接決定了檢測(cè)結(jié)果的可靠性,。為確保游離核酸標(biāo)本檢測(cè)的準(zhǔn)確性,，本文采用了市面上常用的不同品牌游離核酸保存管，就保存效果進(jìn)行了比較,。
2 材料與方法
2. 1 材料
2.1.1保存管及分組
（1）E組：普通抗凝采血管（主要成分EDTA·2Na）,；
（2）S組：Cell-Free DNA BCT（品牌：S公司，REF.2***52）,；
（3）B組：Cell-Free DNA Storage Tube 10mL(品牌：Bioteke,，REF. ST2001)；
（4）K組：Cell-Free DNA Storage Tube 10mL（品牌：K公司,，Cat. CW***6S）,。
2.1.2血液樣本
健康人血10ml,。
2.1.3 試劑及設(shè)備
（1）Premix EX Taq （TaKaRa,Cat.RR390A）；
（2）探針及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成,；
（3）Qubit dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen by Thermo Fisher Scientific）,；
（4）Beta-actin質(zhì)粒由上海捷瑞生物工程有限公司合成；
（5）BioRad-CFX96(BIO-RAD, Foster city, California,，USA）,，Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies，USA),，Mili-Q Advantage A10,，SHZ-82A恒溫振蕩器（常州醫(yī)療器件廠）。
2.2方法
2.2.1血液樣本采集
采用標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺采集年齡22-40歲健康人血10ml,，各組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,，分別裝于采血管及保存管。
2.2.2血漿分離方法
輕柔上下顛倒混勻10次,，800×g,，20min，轉(zhuǎn)移上層血漿至1.5ml離心管,；16,000×g,，室溫，10min,，轉(zhuǎn)移上層血漿至1.5ml離心管凍存-80℃?zhèn)溆?。提取游離核酸前，室溫解凍,，16,000×g,，5min，吸取上層血漿,，進(jìn)行游離核酸提取,。
2.2.3 游離核酸提取方法
根據(jù)QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook 試劑盒操作說(shuō)明操作。
2.2.4 Qubit熒光計(jì)定量血漿游離DNA的濃度
采用Qubit 2.0熒光計(jì)定量血漿游離DNA的濃度,。
2.2.5 Beta-actin拷貝數(shù)的檢測(cè)
Beta-actin 10倍梯度稀釋107-101,，引物分別分actin-F1，actin-R1,，探針為probe actin,，引物及探針工作濃度為5 uM，20ul熒光定量體系引物加入量為各1ul,。
擴(kuò)增程序?yàn)?0°C,、5min，95°C,、10min,，循環(huán)50次,， 95°C,、20s,，65°C、20s,，72°C,、 10min，結(jié)束,。
擴(kuò)增程序試劑組成：
Reagent | 體積（ul） |
Takara Premix | 10 |
Primer F | 1 |
Primer R | 1 |
Probe | 1 |
模板 | 1 |
ddH2O | 補(bǔ)足20ul |
3 結(jié)果
3.1不同天數(shù)下（25°C）游離核酸保存效果的對(duì)比
分別用3種不同的保存管（E,、S及B）采集血液10ml，顛倒混勻15次后立即等分4份至無(wú)抗凝劑無(wú)促凝劑的玻璃采血管中,，保存條件為25°C,。分別于保存第0、3,、7,、14天時(shí)分離血漿，提取游離核酸,。
圖 1不同保存天數(shù)下血液保存現(xiàn)象
圖1 顯示：保存第7天和第14天,，E組出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)更加嚴(yán)重,；S品牌產(chǎn)品保存的血液第7天略微有溶血現(xiàn)象,，第14天時(shí)，溶血嚴(yán)重,。相比之下,，B品牌產(chǎn)品效果較佳。
圖 2 Qubit 檢測(cè)不同保存天數(shù)下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）
圖2 顯示：25°C條件下,，E產(chǎn)品在第0天時(shí),，基因組基本無(wú)釋放；第3,、7,、14天的核酸量隨時(shí)間延長(zhǎng)，基因組釋放量增加明顯,；第14天的核酸檢測(cè)量是第0天的至少2500倍,。 B產(chǎn)品的保存效果在14天之內(nèi)，基本能夠抑制基因組的釋放,；第14天的檢測(cè)結(jié)果為第0天的1.77倍,。S品牌產(chǎn)品7天之內(nèi)，能夠保持cfDNA穩(wěn)定,，基本無(wú)基因組釋放,；但第14天檢測(cè)量劇增,，是第0天的2200倍。
圖3 不同保存天數(shù)下每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)
圖3 顯示：Beta-actin定量結(jié)果趨勢(shì)與Qubit結(jié)果基本一致,，室溫25°C保存3天,，3種保存管的差異不顯著；保存第7天時(shí),，E與B組間的P Value<0.01,，差異極顯著，B與S組 0.01<P value<0.05,，差異具有顯著性,；保存第14天時(shí)，B與S組P value<0.01,，差異極顯著,。
圖4 不同保存天數(shù)下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）
圖4Qubit結(jié)果顯示：三種保存管7天內(nèi)保存效果無(wú)明顯差異，14天時(shí),，K組與S組保存管均出現(xiàn)明顯的上升,，分別是第0天的15.27倍和10.21倍，21天時(shí),，上升較為明顯,，分別是第0天的22.46倍和13.84倍。B組保護(hù)劑保存的血液在第0,、3,、7、14,、21,、28天檢測(cè)時(shí)，每毫升血液cf-DNA濃度均無(wú)明顯的上升,。
圖5 不同保存天數(shù)下每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)
圖5Beta-actin定量結(jié)果與圖4基本一致,。B2組保護(hù)劑保存的血液在第0、3,、7,、14、21,、28天檢測(cè)時(shí),，每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)均無(wú)明顯的上升。
3.2不同天數(shù)下（4°C）游離核酸保存效果的對(duì)比
圖6 不同保存天數(shù)下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）
圖6Qubit結(jié)果顯示：在4°C情況下,，三種保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA濃度并無(wú)明顯的差異,。
圖7 不同保存天數(shù)下每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)
圖7Beta-actin結(jié)果顯示：在4°C情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)并無(wú)明顯的差異。
3.3不同天數(shù)下（37°C）游離核酸保存效果的對(duì)比
圖8 不同保存天數(shù)下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）
圖8Qubit結(jié)果顯示：在37°C情況下,，三種保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA濃度并無(wú)明顯的差異,。
圖9Beta-actin結(jié)果顯示：在37°C情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)并無(wú)明顯的差異,。
3.4運(yùn)輸環(huán)境（25°C）對(duì)游離核酸保存效果的影響
考慮到保存管有可能應(yīng)用于樣品的長(zhǎng)途或短途運(yùn)輸,，因此需用搖床模擬運(yùn)輸環(huán)境對(duì)保護(hù)劑抑制細(xì)胞破裂的影響。S組,、K組及B組分別采集血液一份,，搖床設(shè)置180rpm,，25°C,，分別在0、3,、7,、14天檢測(cè)核酸濃度和beta-actin拷貝量。
圖10 不同保存天數(shù)下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）
圖10Qubit結(jié)果顯示：在25°C模擬震蕩情況下,，三種保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA濃度并無(wú)明顯的差異,。
圖11不同保存天數(shù)下每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)
圖11Beta-actin結(jié)果顯示：在25°C模擬震蕩情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)并無(wú)明顯的差異,。
4.討論
（1）從每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)及每毫升血液cf-DNA濃度兩個(gè)方面來(lái)驗(yàn)證cf-DNA完整性,，已在多篇文獻(xiàn)中[4][5]得到驗(yàn)證。
（2）室溫25°C下,，保存3天時(shí),，3種保存管的差異不顯著；保存第7天時(shí),，E與B組間的差異極顯著,，B與S組差異具有顯著性；保存第14天時(shí),，B與S組P value<0.01,，差異極顯著。在室溫25°C下,，B組較S組及E組,，保存時(shí)間較長(zhǎng)，效果較佳,。
（3）室溫25°C下,，三種保存管7天內(nèi)保存效果無(wú)明顯差異，14天時(shí),，K組與S組保存管均出現(xiàn)明顯的上升,，，21天時(shí),，上升相對(duì)明顯,。B組保護(hù)劑保存的血液在第0,、3、7,、14,、21、28天檢測(cè)時(shí),，每毫升血液cf-DNA濃度均無(wú)明顯的上升,。在室溫25°C下，B組較S組及K組,，保存時(shí)間較長(zhǎng),，效果較佳。
（4）在4°C情況下,，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)及每毫升血液cf-DNA濃度并無(wú)明顯的差異,。在4°C下，B組,、S組及K組,，保存效果無(wú)明顯差異。
（5）在37°C情況下,，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)及每毫升血液cf-DNA濃度并無(wú)明顯的差異,。在37°C下，B組,、S組及K組,，保存效果無(wú)明顯差異。
（6）在25°C模擬震蕩情況下,，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)及每毫升血液cf-DNA濃度并無(wú)明顯的差異,。在25°C模擬震蕩情況下，B組,、S組及K組,，保存效果無(wú)明顯差異。
5.參考文獻(xiàn)
[1]MANDEL P, MÉTAIS P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme ［J］. C R Acad Sci Paris, 1948,142: 241-243.
[2]LEON S A, SHAPIRO B, SKLAROFF D M, et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy ［J］.Cancer Res, 1977, 37(3): 646-750.
[3]STROUN M, ANKER P, MAURICE P, et al. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients［J］. Oncology, 1989, 46(5): 318-322.
[4]Norton S E, Lechner J M, Williams T, et al. A stabilizing reagent prevents cell-free DNA contamination by cellular DNA in plasma during blood sample storage and shipping as determined by digital PCR[J]. Clinical Biochemistry, 2013, 46(15):1561-5.
[5] Ryan W L, Fernando R M, Das K. BLOOD COLLECTION DEVICE FOR STABILIZING CELL-FREE PLASMA DNA:, WO 2013123030 A3[P]. 2013.