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非洲豬瘟病毒檢測整體解決方案
閱讀：3949 發(fā)布時間：2019-2-28非洲豬瘟病毒DNA檢測方案
1.常見樣本類型：
分泌物,、血液,、脾臟、扁桃體,、腎臟和淋巴結(jié)等樣本中的非洲豬瘟,。
2.. 樣品預處理方式（樣本處理區(qū)）
2.1 樣本前處理
2.1.1組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取
0.5g 于研磨器中研磨,，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心2min,，取上清液 200μL 于 1.5mL 滅菌離心管中,；病樣組織直接上機提取也有實驗室在用（江蘇泰州農(nóng)委）
2.1.2全血樣本：取全血離心后的上清（血清） 200μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
相關(guān)實驗設(shè)備：動物組織研磨儀、手持式電動組織研磨儀
根據(jù)樣本數(shù)量多少可用高通量組織破碎儀或者手持式組織研磨儀破碎組織樣本,，之后用離心機將樣本離心分層,，取上清液。
2.2樣本保存和運輸
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃,，長期保存可置-70℃,，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 藍冰和干冰運輸,，嚴禁反復凍融,。
2.3 DNA 提取
對上述處理好的標本加入到預裝好提取試劑的96深孔板中，將加好樣本的耗材放置到96全自動核酸提取儀中提取核酸,。
96全自動核酸提取儀用于病毒核酸的提取,，配套提取試劑可以以散裝形式提供，也可以以預裝的形式提供,，96高通量移液工作站可以用于散裝試劑的分裝,。
3. 試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；樣品每滿 7 份,，多配制 1 份)，將上游引物,、下游引物,、熒光定量探針、酶液預混好,，將混合好反應液分裝到 PCR 反應管中,。舉例如下：
4. 加樣（樣本處理區(qū)）
將提取的 DNA、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取一定量,，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋,，混勻,，短暫離心。
5. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
5.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi),；
5.2 設(shè)置好通道,、樣品信息，反應體系設(shè)置為 20μL,；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,，選擇 None 即可,。
5.3 相關(guān)設(shè)備：
BTK-6 熒光PCR儀,、BTK-10 超快速熒光PCR儀、ABI7500,、LightCycler,、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀,。
6. 結(jié)果分析判定
按照非洲豬瘟核酸檢測試劑盒指導進行判讀,。
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相關(guān)設(shè)備及試劑
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 備注 |
AU1001-96 | 96全自動核酸提取儀 |
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AU1001 | 32全自動核酸提取儀 |
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AU1096A | 96高通量移液工作站 |
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AU52011-96 | 磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒(預裝) | 96次 |
CK2160 | 臺式高速離心機 | 配3號角轉(zhuǎn)子： 24×1.5/2.2ml |
PR7901 | DNA病毒熒光PCR反應液 | 50次 |
PR7911 | 非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒 | 48次 |
BTK-6 | 熒光定量PCR儀 |
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