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中藥活性篩選與活性追蹤實(shí)驗(yàn)
- DPPH法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | DPPH (2,2-二苯基-1-苦味基肼自由基,，2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl)是一種比較穩(wěn)定的脂性自由基，其N上有一個(gè)游離電子,，其乙醇溶液呈紫色,，在517 nm處有大的吸收峰。加入抗氧化劑以后,，DPPH捕捉一個(gè)電子與游離電子配對(duì),，紫色褪去，變?yōu)闊o色物質(zhì),，在517 nm處的吸收消失,，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系。依此原理用分光光度計(jì)檢測(cè)DPPH自由基與試樣液反應(yīng)后吸光值的變化,，可檢定試樣提供氫原子,、清除自由基抗氧化的能力。該法簡(jiǎn)便易行,，靈敏可靠,，不失為篩選天然產(chǎn)物抗氧化劑的好方法之一。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 虎杖厚樸黃芩地榆前胡絞股藍(lán)麥冬葛根菊花白芍 |
| 試劑,、試劑盒 | DPPH無水乙醇二甲基亞砜維生素C |
| 儀器,、耗材 | 圓底燒瓶旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空干燥機(jī)酶標(biāo)板酶標(biāo)儀 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 1. 中藥材選擇：學(xué)生自選4種藥材 備選藥材：虎杖、厚樸,、黃芩,、地榆、前胡,、絞股藍(lán),、麥冬、葛根,、菊花,、白芍 2. 中藥提取 分別將適當(dāng)切碎的中藥材20 g放入250 ml圓底燒瓶中，各加入10倍量乙醇,，回流提取1次,，過濾后提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，并用真空干燥機(jī)干燥,，備用,。 3. 試劑的配制 DPPH溶液：稱取3.2 mg DPPH溶解于40 ml無水乙醇中,，搖勻，備用,。 提取物溶液：用二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑配成濃度為5 mg/ml的溶液,，備用。測(cè)定時(shí)稀釋成相應(yīng)濃度,。 維生素C溶液：DMSO作為溶劑配成濃度為0.5 mg/ml的溶劑,，備用。 4. 活性藥材的篩選 取10 μL的樣品溶液放入酶標(biāo)板中,，再加入90 μL的DPPH溶液,，以維生素C溶液做陽性對(duì)照，以DPPH溶液作為標(biāo)準(zhǔn),，樣品溶液為空白,，室溫放置30 min后，酶標(biāo)儀517 nm測(cè)定,，利用以下公式計(jì)算各種樣品的清除率(k),，每個(gè)樣品測(cè)定2次(按下圖所示加樣)。
式中： Ae -- DPPH + 提取物混合溶液的吸光度 A0 -- 提取物溶液的吸光度 AD -- DPPH溶液的吸光度 AD0 -- DMSO+乙醇的吸光度 5. 活性藥材的活性成分追蹤 自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),，對(duì)通過上述活性篩選出的活性的藥材,，進(jìn)行提取和分離，對(duì)不同的流份進(jìn)行進(jìn)一步的活性追蹤評(píng)價(jià),。 |
