凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)常見問答
1. 什么是凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn),?
凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù),可用于定性和定量分析,。這一技術(shù)zui初用于研究DNA結(jié)合蛋白,,目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫,,在非變性的聚丙烯凝膠電泳上,,分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA復(fù)合物或RNA復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢,。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同,,可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測(cè)如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白,,可用純化蛋白,,部分純化蛋白,,或核細(xì)胞抽提液。在檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白時(shí),,依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置,可用純化或部分純化的蛋白,,也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液,。競爭實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA pian段和寡核苷酸片段(特異),和其它非相關(guān)的片段(非特異),,來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性,。在競爭的特異和非特異片段的存在下,依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合,。
2. 實(shí)驗(yàn)中需要用到什么試劑,?
凝膠遷移實(shí)驗(yàn)需要的結(jié)合蛋白,可來源于純化或部分純化的蛋白,,或粗的核和胞質(zhì)抽提液,。還必須制備同位素標(biāo)記的DNA或RNA。一般,,DNA核苷酸探針用32P和T4多核苷酸激酶來作末端標(biāo)記,,同位素標(biāo)記的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標(biāo)記的核苷酸在體外合成。Promega公司的Riboprobe/sup系統(tǒng)(a,b)可用于同位素標(biāo)記的RNA的體外合成,,DNA 5'末端標(biāo)記系統(tǒng),,用于制備DNA探針,結(jié)合反應(yīng)所需的組分有:含鹽的溶液,,包括(氯化鎂,,氯化鈉,或氯化jia),、緩沖體系(Tris-HCl或HEPES),、還原劑(DTT)、甘油,、非特異的競爭DNA(poly(dI:dC)dI:dC),,也可能含非離子去污劑。在結(jié)合蛋白和同位素標(biāo)記的探針作用后,,在非變性的聚丙烯凝膠電泳上,,分離復(fù)合物,隨后將凝膠干燥并放射自顯影,,或用PhosphorImage/sup分析,。
3. 凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)提供了什么試劑?
Promega公司提供一種凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白,,系統(tǒng)可作為這類實(shí)驗(yàn)的一種陽性對(duì)照,。系統(tǒng)包括目的寡核苷酸,,對(duì)照DNA結(jié)合蛋白,結(jié)合緩沖液,,用于寡核苷酸探針末端標(biāo)記所需的試劑,。Core 系統(tǒng)包括含重組AP2蛋白(AP2抽提液)的大腸桿菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是從表達(dá)AP2蛋白的大腸桿菌中提取的,。另外,,Core系統(tǒng)還含SP1同源寡核苷酸,凝膠遷移結(jié)合緩沖液,,和能作20次對(duì)照實(shí)驗(yàn)的HeLa核抽提液,。Complete系統(tǒng)含另外5個(gè)雙鏈寡核苷酸,分別是AP1,、OCT1,、CREB、NF-kB,、 TFIID結(jié)合位點(diǎn)的同源序列,。這些寡核苷酸可以在末端標(biāo)記后用作特異性探針,或在競爭實(shí)驗(yàn)中用作非特異性探針,。
4. 成功進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn),,需要優(yōu)化哪些因素?
凝膠遷移實(shí)驗(yàn)在理論上很簡單也很快速,,但要成功地進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn),,需要優(yōu)化一些參數(shù),這主要受結(jié)合蛋白的來源和探針結(jié)合位點(diǎn)特點(diǎn)的影響,。以下是需要優(yōu)化的因素:抽提液的制備(核酸酶和磷酸酶污染會(huì)使探針降解),,結(jié)合蛋白的濃度,探針的濃度,,非特異性探針的濃度,,緩沖液的配方和pH,聚丙烯凝膠電泳的特點(diǎn)和電泳條件,,保溫時(shí)間和溫度,,載體蛋白,是否有輔助因子(比如鋅,,或鎘等金屬離子,,或激素)??傊?,反應(yīng)總體積應(yīng)zui小(20μl)。為滿足一般要求,,結(jié)合緩沖液含4%甘油,,1mM MgCl2,0.5mM EDTA,,0.5mM DTT,,50mM NaCl,10mM Tris-HCl(pH7.5),, 0.05mg/ml poly dI:dC,,或10mM HEPES(pH7.9), 50mM KCl,,1mM DTT,, 1mM EDTA,,10%甘油,,0.05mg/ml poly dI:dC可作為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的起始。
5. 在DNA探針的選擇上,,要考慮哪些重要因素,?
目的DNA的長度應(yīng)小于300bp,以有利于非結(jié)合探針和蛋白DNA復(fù)合物的電泳分離,。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中用作探針,。如目的蛋白已被鑒定,則應(yīng)用短的寡核苷酸片段(約為25bp),,這樣結(jié)合位點(diǎn)可和其他因子的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)別開,。長的限制性酶切片段可用于對(duì)推定的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)定位。隨后可用DNaseI 印跡對(duì)蛋白結(jié)合的特異區(qū)域在DNA序列水平上作出分析,。
6. 用以下一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和HeLa細(xì)胞核抽提物可形成哪些復(fù)合物:AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB,。
當(dāng)用HeLa細(xì)胞核抽提物作為結(jié)合蛋白的來源時(shí),每1個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和它相關(guān)的DNA同源序列結(jié)合形成特征型的結(jié)合形態(tài),。以下的文字描述了每一個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,,包括識(shí)別的同源序列,因子的大小,,特定的結(jié)合條件,,以及和HeLa細(xì)胞核抽提物可形成的復(fù)合物的數(shù)目。