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貼壁,、懸浮,、原代細胞感染Protocol及常見問題解答
慢病毒是當前zui熱門的基因操作工具，其感染譜廣,，可有效地感染腫瘤細胞,、神經(jīng)元細胞、心肌細胞,、內(nèi)皮細胞,、干細胞等多種類型的細胞，從而為基因功能的研究提供了更強有力的工具,。然而仍有一部分細胞,，尤其是原代細胞和懸浮細胞由于細胞特性，很難獲得的感染效率,。為了提高細胞的感染效率,，我們常常選擇多加病毒或使用Polybrene等助感染試劑,，然而細胞狀態(tài)卻變差了，且增加感染效率并沒有達到理解的效果,，這是什么原因呢,？
一、對慢病毒感染出現(xiàn)的問題進行原因分析
1. 細胞狀態(tài)變差——細胞毒性
- 雜質(zhì)：病毒溶液中殘留的雜質(zhì)蛋白,、內(nèi)毒素及宿主細胞DNA等是造成細胞毒性的主要因素。特別對于某些外源刺激敏感的細胞來說,，嚴重時將導(dǎo)致細胞死亡,。這是病毒感染細胞后，狀態(tài)差異的主要原因,。
- 過度感染：外源基因過度表達,，會導(dǎo)致目的細胞本身正常新陳代謝失衡。這是有些細胞過感會死亡的主要原因,。
2. 病毒加了不少,，效果不理想，如何增加感染效率——了解影響慢病毒感染效率的因素
- 細胞膜的流動性
- 細胞膜表面受體的表達豐度
- 病毒與細胞的接觸面積和接觸幾率
- 細胞膜與病毒外殼蛋白電荷的多少
二,、如何有針對性地增加慢病毒感染效率
了解了影響細胞狀態(tài)和感染效率的原因后,，我們就可以有針對性的進行調(diào)整。
1. 使用高滴度高純度的慢病毒,，可以減少病毒中的雜質(zhì)對細胞狀態(tài)的影響：降低慢病毒對細胞的毒性
2. 調(diào)整細胞狀態(tài),，感染時使用對數(shù)期的細胞：增加細胞膜的流動性
3. 降低感染時血清濃度，使用無血清/低血清的培養(yǎng)基：降低血清蛋白對病毒外殼蛋白的封閉
4. 離心法,，感染時將細胞培養(yǎng)板密封,，用平角轉(zhuǎn)子離心機1000g離心1h，再放回培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)：增加慢病毒與細胞的接觸幾率,，但對細胞有一定的機械損傷,，儀器要求高
5. 感染時加入Rentronectin等纖粘蛋白：增加慢病毒與細胞接觸幾率，但會影響細胞的貼壁狀態(tài)
6. 使用傳統(tǒng)的助感染試劑,，如Polybrene：中和細胞膜和病毒粒子之間的電荷排斥,，但Polybrene本身就具有細胞毒性，部分細胞對Polybrene敏感,，容易導(dǎo)致細胞狀態(tài)變差,、形態(tài)發(fā)生變化、甚至死亡,。
三,、特殊細胞慢病毒感染注意事項
1. 懸浮細胞
對于懸浮細胞，可采用離心感染方法提高感染效率,。如將細胞培養(yǎng)板密封后,，用平角轉(zhuǎn)子離心機1000g離心1h,，再放回培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。
2. 極難感染的細胞
對于極難感染的細胞,，可采用多次感染的方法,，即感染一次后，重新加入新鮮病毒再次感染,，可顯著提升感染效率,。但需要注意調(diào)整兩次感染間細胞狀態(tài)。
3. 傳代能力較差的原代細胞,、非分裂細胞
原代細胞：由于細胞增長緩慢,，可以在接種時提高匯合度到50%～60%，確保在感染后4天時細胞匯合度達到90%～100%,；
非分裂細胞：如神經(jīng)元細胞,，接種后不再增殖，需要按照100%的匯合度進行接種,。
Q：慢病毒如何稀釋,？
A：用常規(guī)培養(yǎng)基、生理鹽水,、Hanks液,、PBS液等將慢病毒稀釋到需要的滴度。如原病毒標記滴度為5 x 108 TU/ml,，則取20 µl病毒液加入到80 µl的常規(guī)培養(yǎng)基中,，即可得到1 x 108 TU/ml的病毒稀釋液。
Q：如何確定向細胞中加入慢病毒的*時間,？
A：慢病毒感染細胞后需要4天的時間才能觀察到慢病毒攜帶的基因表達,，應(yīng)在細胞匯合度20~40%時且細胞狀態(tài)良好時加入慢病毒，確保在感染后4天時細胞增長達到90%～100%的匯合度,。
Q：加入慢病毒病毒后,，細胞死亡很厲害，該如何處理,？
A：這種情況是由于慢病毒對該細胞有一定的毒性作用,，需要調(diào)整并降低感染的MOI值，并且在感染后4小時,、8 小時,、12 小時對細胞進行觀察，若發(fā)現(xiàn)細胞狀態(tài)變差時,，則需要立刻對細胞進行換液操作,，使用新鮮的*培養(yǎng)液替換病毒感染培養(yǎng)液。
Q：如何提高慢病毒對細胞的感染效率,？
A：慢病毒對細胞的感染效率受多個因素影響,，如細胞自身生長的狀態(tài),，細胞數(shù)量，細胞被慢病毒感染的難易程度等,。因此保證細胞正常增殖,，輪廓清晰，合適的細胞密度,，選擇*的感染條件可以更好的保證感染效率,。對于懸浮細胞，可采用離心感染方法,，減少病毒感染時的體積,，從而提高感染效率。如將細胞培養(yǎng)板密封后,，用平角轉(zhuǎn)子離心機1000g離心1h，再放回培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng),。