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實驗方法原理

平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產(chǎn)物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產(chǎn)物純化后,，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）,。

如果要求不高，PCR產(chǎn)物也可不加處理,。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶,，這兩種酶有5’→3’校對能力，擴增出來的PCR產(chǎn)物已經(jīng)是平頭,，可以不作平端處理,。平端連接的一個顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶,，或在反應(yīng)體系中加入PEG 8000,，也只能很有限地提率。

通常情況下,，PCR產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進行連接,，但其連接效率效低。因為Taq DNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性,，能在兩6條 DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基,，使合成的PCR產(chǎn)物成為3'突出一個堿基的DNA分子。

這種DNA分子的連接效率很低,。由于PCR產(chǎn)物的效率通過較高,，在采用大量T4 DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率,。

對于較短PCR產(chǎn)物,，用PUS19的HincⅡ位點進行克隆，以X-gal和IPTG篩選,，?？傻玫阶懔恐亟M子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產(chǎn)物變成平端DNA,，然后再用平端連接法克隆PCR產(chǎn)物,。

實驗材料

模板DNA

試劑、試劑盒

SauIKlenow片段T4連接酶

儀器,、耗材

移液器,、移液器吸頭、PCR小管,、DNA擴增儀,、電泳槽、電泳儀,、臺式高速離心機

實驗步驟

一、PCR反應(yīng)

1.  依次混勻下列試劑

（1）H₂O：35 μl

（2）10×PCR反應(yīng)緩沖液：5 μl

（3）25 mmol/L MgCl₂：4 μl

（4） 4種dNTP：4 μl

（5）上游引物（引物1）：0.5 μl

（6）下游引物（引物2）：0.5 μl

（7）模板DNA（約1 ng）：0.5 μl

（8）混勻后離心5秒,。

2.  將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷,，迅速離心數(shù)秒,， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5 μl約2.5 U）,，混勻后稍離心,，加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。

3.  用94℃變性1分鐘,，45℃退火1分鐘,， 72℃延伸2分鐘， 循環(huán)35輪,，進行PCR,。zui后一輪循環(huán)結(jié)束后， 于72℃下保溫10分鐘,，使反應(yīng)產(chǎn)物擴增充分,。

二、電泳

取10 μl擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進行電泳分析,，檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長度,。

三、PCR產(chǎn)物的純化

擴增的PCR產(chǎn)物如利用T-Vector進行克隆,，可直接使用,，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產(chǎn)物純化,。

1.  酚/氯fang法

（1）取反應(yīng)產(chǎn)物加100 μl TE,。

（2）加等體積氯fang混勻后用微型離心機10000 rpm離心15秒，用移液器將上層水相吸至新的小管中,。這樣抽提一次,， 可除去覆蓋在表面的礦物油。

（3）再用酚:氯fang:異戊醇抽提二次,，每次回收上層水相,。

（4）在水相中加300 μl 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀,。

（5）在小離心機上10000 rpm離心10 min,，吸凈上清液。加入1 ml 70％乙醇,，稍離后,，吸凈上清液.重復洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7 ml ddH₂O 中,，待用,。

2.  Wizard PCR DNA純化系統(tǒng)

Wizard PCR DNA純化系統(tǒng)可以快速、有效、可靠地提取PCR擴增液中的DNA,，提純后的DNA可用于測序,、標記、克隆等,。 該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可供50次PCR產(chǎn)物的純化,，試劑包括：50 ml Wizard PCR DNA純化樹脂、5 ml 直接提取緩沖液,、50支 Wizard微型柱,。

（1）吸取PCR反應(yīng)液水相放于1.5 ml eppendorf管中。

（2）加100 ml直接提取緩沖液,，渦旋混勻,。

（3）加1 ml PCR DNA純化樹脂，1分鐘內(nèi)渦旋混合3次,。

（4）取一次性注射器,， 取出注塞，并使注射筒與Wizard微型柱連接,，用移液槍將上述混合液加入注射筒中,，并用注塞輕推，使混合物進入微型柱,。

（5）將注射器與微型柱分開,，取出注塞， 再將注射筒與微型柱相連,，加入2 ml 80%異丙醇,，對微型柱進行清洗。

（6）取出微型柱置于eppendorf管中,，12 000 g離心20秒,，以除去微型柱中的洗液。

（7）將微型柱放在一個新eppendorf管中,，加50 μl TE或水,，靜止1分鐘后，12 000 g離心20秒,。

（8）丟棄微型柱,，eppendorf管中的溶液即為純化DNA，存放于4℃或-20℃,。

四,、載體加dT尾

1.  將1 μg pUC19用SmaⅠ全酶切。

2.  在小管中按上述PCR反應(yīng),，加入各種混合物,，除將4 μl 4種dNTP改為4 μl 25 mM dTTP,。

3.  加入1 μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加熱2 h。

4.  按前面三中所述,，用酚:氯fang:異戊醇抽提二次,。

5.  加入2倍體積 95％乙醇,，在-20℃下沉淀1 h,。

6、離心,，用70%乙醇漂洗后,，真空抽干，溶于10ml ddH2O中,。

五,、PCR產(chǎn)物與載體粘末端連接

1.  在7 ml PCR產(chǎn)物中加1 ml帶dT尾的pUC質(zhì)粒。

2.  加1 ml T4DNA連接酶,，1 ml 10×連接緩中液,，混勻，16℃連接過夜,。

3.  取5 ml連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞并篩選重組子,。

六、PCR產(chǎn)物3'突出端切平及平末端連接

1.  在50 ml的PCR產(chǎn)物中,，直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混勻,。

2.  37℃反應(yīng)10分鐘后，70℃滅活10分鐘,。

3.  用酚:氯fang抽提2次,。

4.  乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后,，真空抽干，溶于7 ml ddH₂O中,。

5.  質(zhì)粒用Smal 切開后,，70℃ 15分鐘滅活酶，取1 ml （約0.1 mg）加入上述PCR產(chǎn)物中,。加T4 DNA連接酶1 ml ,，連接緩沖液1 ml 。

6.  取5 ml 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞并篩選重組子,。

收起 

注意事項

1.  PCR反應(yīng)液可直接用于連接,，但zuihao對PCR產(chǎn)物純化后進行連接，既能去掉dNTP與ATP競爭連接酶又能濃縮PCR產(chǎn)物,。

2.  PCR非常靈敏,， 操作應(yīng)盡可能在無菌操作臺中進行,。

3.  吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌,， 每次吸頭用畢應(yīng)更換,， 不要互相污染試劑。

4.  加試劑前,， 應(yīng)短促離心10秒鐘,， 然后再打開管蓋， 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面,。

5.  應(yīng)設(shè)含除模板DNA所有其它成分的負對照,。

6.  純化樹脂在使用前必須充分混勻。

7.  PCR產(chǎn)物中礦物油應(yīng)盡量吸去,，否則會影響提取DNA的 產(chǎn)量,。

收起 

其他

一、 PCR反應(yīng)中的主要成份

1.  引物

PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定,。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵,。引物設(shè)計和選擇目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則：

（1） 引物長度約為16-30 bp， 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對,，從而使非特異性增高,。太長則比較浪費，且難以合成,。

（2）引物中G+C含量通常為40%-60%,，可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。

（3）四種堿基應(yīng)隨機分布,，在3'端不存在連續(xù)3個G或C,，因這樣易導致錯誤引發(fā)。

（4）引物3'端與目的序列閱讀框架中密碼子*或第二位核苷酸對應(yīng),， 以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對,。

（5）在引物內(nèi)， 尤其在3'端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu),。

（6）兩引物之間尤其在3'端不能互補,， 以防出現(xiàn)引物二聚體， 減少產(chǎn)量,。兩引物間zuihao不存在4個連續(xù)堿基的同源性或互補性,。

（7）引物5'端對擴增特異性影響不大， 可在引物設(shè)計時加上限制酶位點,、核糖 體結(jié)合位點,、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素,、熒光素,、地gao辛等,。通常應(yīng)在5'端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。

（8）引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補,。所擴增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu),， 以免產(chǎn)生非特異性擴增，影響產(chǎn)量,。

（9）簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子,， 例如選用只有一種密碼子的Met， 3'端應(yīng)不存在簡并性,。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴增產(chǎn)物,。

（10）一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0 μmol/L,。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導或產(chǎn)生引物二聚體,， 過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計,， 可計算引物濃度,， 在1cm光程比色杯中，260nm下,，引物濃度可按下式計算：

X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)

X： 引物摩爾濃度,，A、C,、G,、T：引物中4種不同堿基個數(shù)。

2.  4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)

（1）dNTP應(yīng)用NaOH 將pH調(diào)至7.0,，并用分光光度計測定其準確濃度,。

（2）dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分裝，-20℃貯存,。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200 μmol/L,。

（3）理論上4 種 dNTP各20 μmol/L，足以在100 μl反應(yīng)中合成2.6 μg的DNA,。當dNTP終濃度大于50 mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性,。4種dNTP的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入,。

3.  Mg²⁺

（1）Mg²⁺濃度對Taq DNA聚合酶影響很大,，它可影響酶的活性和真實性，影響引物退火和解鏈溫度,， 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等,。

（2）通常Mg²⁺ 濃度范圍為0.5-2 mmol/L.對于一種新的PCR反應(yīng)，可以用0.1-5 mmol/L的遞增濃度的Mg²⁺ 進行預備實驗,，選出zui適的Mg²⁺濃度,。

（3）在PCR反應(yīng)混合物中,， 應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團， 例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg²⁺ 離子濃度的物質(zhì),，以保證zui適Mg²⁺ 濃度,。

4.  模板

（1）PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進行擴增， 模板DNA可以是單鏈分子,，也可以是雙鏈分子,，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好),。

（2）就模板DNA而言,，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度.一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102 -105 個拷貝，對于單拷貝基因,，這需要0.1μg的人基因組DNA,，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA.擴增多拷貝序列時,，用量更少,。

（3）靈敏的PCR可從一個細胞，一根頭發(fā),，一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列,。

（4）模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質(zhì)也會影響PCR的效率,。

5.  Taq DNA聚合酶

一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130 min,，95℃ 40 min， 97℃ 5 min?，F(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶,，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間。

Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,，30 min,，摻入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率,，一般PCR中出錯率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán),，在利用PCR克隆和進行序列分析時尤應(yīng)注意.在100 μl PCR反應(yīng)中，1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進行30輪循環(huán),。

所用的酶量可根據(jù)DNA,、引物及其它因素的變化進行適當?shù)脑鰷p.酶量過多會使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低,。

反應(yīng)結(jié)束后,，如果需要利用這些產(chǎn)物進行下一步實驗，需要預先滅活Taq DNA聚合酶,， 滅活Taq DNA聚合酶的方法有：

（1）PCR產(chǎn)物經(jīng)酚:氯fang抽提,，乙醇沉淀,。

（2）加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg²⁺ 。

（3） 99-100℃加熱10 min,。目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用,。

6.  反應(yīng)緩沖液

（1）反應(yīng)緩沖液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8)， 50 mmol/L KCl和適當濃度的Mg₂₊ ,。Tris·Cl在20℃時pH為8.3-8.8,，但在實際PCR反應(yīng)中，pH為6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火,。

（2）反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),，它們可穩(wěn)定酶活性，另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對擴增較長的DNA片段有利,。

（3）各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液,。