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簡(jiǎn)述核酸探針技術(shù)及其在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用
隨著分子生物學(xué)和分子化學(xué)的飛速發(fā)展，對(duì)病原微生物的鑒定已不再局限于對(duì)它的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理特性等一般檢驗(yàn)上,，而是從分子生物學(xué)水平上研究生物大分子,，特別是核酸結(jié)構(gòu)及其組成部分。在此基礎(chǔ)上建立的眾多檢測(cè)技術(shù)中,，核酸探針（Nuclear acid probe）以其敏感,、特異、簡(jiǎn)便,、快速的特點(diǎn)成為世人矚目的生物技術(shù)革命的新產(chǎn)物,，已逐步應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)。
核酸探針是將已知核苷酸序列DNA pian段用同位素或其他方法標(biāo)記,，加入已變性的被檢DNA中 ,，在一定條件下即可與該樣品中有同源序列的DNA區(qū)段形成雜交雙鏈，從而達(dá)到鑒定樣品中DNA的目的,，這種能認(rèn)識(shí)到特異性核苷酸序列有標(biāo)記的單鏈DNA分子就稱(chēng)為核酸探針或基因探針,。根據(jù)核酸探針中核苷酸成分的不同，可將其分為DNA探針或RNA探針,，一般大多選用DNA探針,；根據(jù)選用基因的不同分為兩種，一種探針能同微生物中全部DNA分子中的一部分發(fā)生反應(yīng),，它對(duì)某些菌屬,、菌種、菌株有特異性，另一種探針只能限制性同微生物中某一基因組DNA發(fā)生雜交反應(yīng),，如編碼致病性的基因組,，它對(duì)某種微生物中的一種菌株或僅對(duì)微生物中某一菌屬有特異性。這類(lèi)探針檢測(cè)的基因相當(dāng)保守,，包括大部分rRNA,，因?yàn)樗瓤赡茉谝环N微生物中出現(xiàn)，又可代表一群微生物,。如應(yīng)用rRNA探針檢測(cè)作為篩選食品污染程度的指示菌E.Coli,。選擇探針的原則是只能同檢測(cè)的細(xì)菌發(fā)生雜交反應(yīng)，而不受非檢菌存在的干擾,。
1 核酸探針的特點(diǎn)：
1.1探針的特異性
核酸探針檢測(cè)技術(shù)的zui大特點(diǎn)是特異性，就是說(shuō)一個(gè)適當(dāng)組建的DNA探針能特異性地與所檢微生物而不與其他微生物發(fā)生反應(yīng),。對(duì)食品檢測(cè)而言,，就是不與樣品中內(nèi)源性雜菌和樣品自身DNA發(fā)生非特異性反應(yīng)。以往檢測(cè)方法檢測(cè)的是基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物）,。檢測(cè)這種物質(zhì)受多種因素影響,。比如食品中微生物因受應(yīng)激損傷（高溫、冷凍,、化學(xué)制劑等）會(huì)導(dǎo)致基因組的變化,，從而引起其表達(dá)產(chǎn)物的變化。而核酸探針檢測(cè)的基因本身,，它能識(shí)別基因本身的變異,，不受基因表達(dá)產(chǎn)物的影響。常規(guī)免疫學(xué)方法檢測(cè)抗原,、抗體,，他們都是蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)由氨基酸組成,，而氨基酸由核苷酸序列確定,，一旦這種序列受外界影響發(fā)生變異，就會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)物的變化,，影響抗原抗體間的反應(yīng),，使檢測(cè)特異性下降。檢測(cè)病毒主要通過(guò)組織培養(yǎng)后,，檢測(cè)病毒相關(guān)的蛋白質(zhì)囊膜,，即使采用超低溫保存，有時(shí)也會(huì)引起編碼蛋白質(zhì)囊膜基因的變化,，而采取DNA探針檢測(cè)病毒則不用改變其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),，而只需檢測(cè)是否有相應(yīng)特異性的編碼蛋白質(zhì)囊膜的病毒靶DNA序列。另外，核酸之間的識(shí)別連接比抗原抗體準(zhǔn)確,，并且探針檢測(cè)比免疫學(xué)方法靈活,。盡管看來(lái)形成抗原抗體復(fù)合物比核酸雜交快，但能通過(guò)加磺化葡聚糖把退火速度增加100倍,，從而提高反應(yīng)速度,，核酸比蛋白質(zhì)耐受高溫（100℃）、有機(jī)溶劑,、螯合劑和高濃度工作液的破壞作用,，所以用比提取蛋白質(zhì)強(qiáng)烈的多的方法制備核酸，不會(huì)影響雜交反應(yīng),。當(dāng)然RNA探針除外,，因?yàn)?/span>RNA不耐受堿處理，需用其它方法制備檢測(cè)用RNA,。核酸探針的特異性取決于探針的堿基序列和使用條件,，如在不嚴(yán)格條件下（低溫高鹽）探針與靶DNA誤交結(jié)合力比嚴(yán)格條件下穩(wěn)定。探針長(zhǎng)度也會(huì)影響反應(yīng)的特異性,，一般加Formamide增加反應(yīng)特異性,。
1.2 探針的敏感性
研制核酸探針是為了檢測(cè)出單個(gè)病毒和細(xì)菌。DNA探針敏感性取決于探針本身和標(biāo)記系統(tǒng),。32P標(biāo)記物通?？蓹z出10－8摩爾特異DNA pian段，相當(dāng)于0.5pg,，1000個(gè)堿基對(duì)的靶系列,，相當(dāng)于1000－10000個(gè)細(xì)菌。用親和素標(biāo)記探針檢測(cè)1小時(shí)培養(yǎng)物DNA含量在110pg,，兩者敏感性大致相同,，而血清學(xué)方法只能達(dá)到1ng的水平。延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,，增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度能提高探針的敏感性,。非放射性物標(biāo)記探針在高濃度情況下，由于抑制了非特異性吸附,，比放射性物標(biāo)記探針背景干擾小,。在探針上加生物素化的核苷酸長(zhǎng)尾能使檢測(cè)敏感性提高10倍。細(xì)胞中rRNA比rDNA多,，檢測(cè)rRNA比rDNA敏感,。通過(guò)擴(kuò)增DNA含量也能提高檢測(cè)敏感性。
2 核酸探針技術(shù)在食源性病原微生物檢測(cè)上的應(yīng)用
2.1 沙門(mén)氏菌
食品中沙門(mén)氏菌污染量小,，常受應(yīng)激損傷,，不易恢復(fù)，現(xiàn)用檢測(cè)方法得到陰性報(bào)告zui少需四天，陽(yáng)性報(bào)告還要延遲2－3天,。研究檢測(cè)沙門(mén)氏菌的探針難度大,，因?yàn)樗鼡碛?/span>2000多個(gè)血清型，還不清楚它們是否存在共同特異性的致病因子,。Fillal等人從染色體序列和構(gòu)建的質(zhì)粒文庫(kù)中分離到一個(gè)適用于沙門(mén)氏菌檢測(cè)的探針,。它能和沙門(mén)氏菌而不和其他微生物及樣品培養(yǎng)基發(fā)生非特異性反應(yīng)。這種用同位素標(biāo)記的探針,，能識(shí)別350株不同的沙門(mén)氏菌,。由于該方法zui小檢出量只有1個(gè)細(xì)菌/25克樣品，所以需要增菌培養(yǎng),。AOACzui近認(rèn)可了Gene-Tark沙門(mén)氏菌比色分析法,，這種探針標(biāo)記物為異硫氰酸熒光素（FITC）,再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗FITC的抗體結(jié)合放大探針，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶浸染棒固相薄膜上雜交,，對(duì)239株沙門(mén)氏菌的特異性檢出率為100%,，假陽(yáng)性率為0.8%(BAM/AOAC培養(yǎng)法假陽(yáng)性率為2.2%)。
2.2 大腸桿菌
大腸桿菌是食品和水源污染糞便的指示菌,。Tark研制出用浸染棒檢測(cè)大腸桿菌中16srRNA的探針。樣品需要前增菌處理,，以異硫氰熒光素（FITC）標(biāo)記探針,，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗FITC抗體檢測(cè)雜交復(fù)合物。Hsu等報(bào)道其特異性達(dá)100%,，假陽(yáng)性率為1.2%（目前使用的BNM/AOAC法為23.4%）,。Sander等構(gòu)建了一個(gè)能檢測(cè)產(chǎn)生與志賀氏菌毒素相同毒素的大腸桿菌菌株（SLTEC）的探針。增菌后能檢測(cè)牛肉和其它食品中是否存在有SLTEC,。1990年Feng.p等研制出大腸桿菌GUD（β－葡萄糖醛酸酶 ）基因的探針,，GUD是AOAC認(rèn)可的MUG（4－甲基傘形酮β－葡萄糖醛酸）試驗(yàn)中檢測(cè)的酶，現(xiàn)用PCR法擴(kuò)增GUD基因,，再用DNA探針雜交,。MUG試驗(yàn)既MUG在GUD作用下釋放出4－甲基7－羥香豆素，它在長(zhǎng)波紫外光照射下產(chǎn)生藍(lán)色熒光,。
2.3 李斯特桿菌
1981年確定它是一種食源性病原菌,，1985年加利福尼亞發(fā)生爆發(fā)性流行，現(xiàn)用檢測(cè)方法大多采用冷增菌,，費(fèi)時(shí)費(fèi)力,。FDA于1987年研制出針對(duì)李斯特菌致病基因β－溶血素的探針，隨后GENE-TARK研制出商品化檢測(cè)李斯特菌的DNA探針,，它能特異性識(shí)別細(xì)菌的16SrRNA,。該探針是由人工合成的寡核苷酸，用比色法檢測(cè)樣品；需先在LEB中培養(yǎng)16－22h,然后浸染比色檢測(cè),。
2.4 弧菌 國(guó)外對(duì)DNA探針和單克隆抗體法在檢測(cè)鞭毛方面作了比較,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA探針?lè)?yáng)性檢出率高。近年來(lái)用PCR擴(kuò)增DNA pian段,，再做探針檢測(cè),，能檢出新鮮龍蝦仁中的弧菌，檢測(cè)靈敏度為10個(gè)細(xì)菌/克,，但要用凝膠電泳進(jìn)一步鑒定,。因此不太適合檢測(cè)食品。1989年Olive構(gòu)建了一個(gè)熱穩(wěn)定溶血素基因的寡核苷酸DNA探針檢測(cè)副溶血弧菌,。
2.5 彎曲桿菌
檢測(cè)彎曲桿菌的探針是用非放射性物質(zhì)標(biāo)記的,。標(biāo)記物為發(fā)光素，靶序列為rRNA,。近年來(lái)用堿性磷酸酶標(biāo)記人工合成的寡核苷酸檢測(cè)人工污染的糞便樣品,，檢測(cè)量為100000個(gè)菌落形成單位（CPU），敏感性和特異性達(dá)100%,。
2.6 葡萄球菌 大多數(shù)檢測(cè)葡萄球菌的探針是針對(duì)腸毒素的,，它們能同編碼腸毒素有關(guān)的基因序列雜交，這類(lèi)探針能檢測(cè)腸毒素A,、B,、C和E。zui近,，Gene Tark推出檢測(cè)金黃色葡萄球菌的探針,，方法采用浸染棒比色法，探針檢測(cè)的基因序列是23SrRNA,。敏感性100%,，假陽(yáng)性率為9.3%。