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包涵體復(fù)性注意事項(xiàng)和常見(jiàn)問(wèn)題解析
包涵體復(fù)性注意事項(xiàng)
1)zui適pH值范圍為8.0-9.0之間,；
2)溫度適宜選擇4℃,；
3)復(fù)性過(guò)程蛋白濃度不宜過(guò)大，一般為0.1-0.2mg/mL,；
4)復(fù)性時(shí)間一般為24-36小時(shí),；
5)低分子化合物如L-Arg有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度；脲,、鹽酸胍,、烷基脲、以及碳酸酰胺類等,，在非變性濃度下是很有效的促進(jìn)劑,，都可阻止蛋白聚集；Tris對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用,；EDTA可以防止蛋白降解,；
6)首先要獲得較高純度的包涵體；
7)包涵體溶解要*,，一般應(yīng)使溶解液體量較大,，不要怕蛋白被稀釋，要有助溶措施,；
8)透析前后均要離心,；
9)包含體要*洗滌干凈，洗滌液中加入適量Triton-X100,；
10)包含體溶解后裝入透析袋在復(fù)性液中復(fù)性,；
11)復(fù)性完畢在低濃度的緩沖液中連續(xù)緩慢透析12-24h；
12)復(fù)性率的測(cè)定時(shí)要據(jù)變性蛋白和非變性蛋白的光學(xué)性質(zhì)不同測(cè)定
13)TritionX100、SDS這一類去垢劑zui后不易去除,，在制藥行業(yè)中一般不允許采用,。用Triton洗滌有些包涵體效果不是很好。包涵體洗滌是純化極為重要的一步,，改變培養(yǎng)條件,，再洗滌包涵體，有時(shí)可以在上柱前已經(jīng)只剩下3-4條雜帶,，這樣后續(xù)的純化就很方便了,。
14)復(fù)性時(shí)的蛋白濃度一般為0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉淀,，太低的濃度不經(jīng)濟(jì),，而且很多蛋白在低濃度時(shí)不穩(wěn)定，很容易變性,。
包涵體復(fù)性常見(jiàn)問(wèn)題分析
包涵體復(fù)性原則
低濃度,，平緩梯度，低溫,。
怎樣洗滌包涵體,？
通常的洗滌方法一般是洗不干凈的，可以先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分,，過(guò)濾除去未溶解的物質(zhì),，注意留樣跑電泳，然后用水稀釋到4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳,，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度,，可以找到一個(gè)合適去除雜質(zhì)的辦法，其實(shí)這就是梯度沉淀的方法,，比通常的直接洗脫效果好,。
對(duì)于尿素和鹽酸胍該怎么選擇
尿素和鹽酸胍屬中強(qiáng)度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去,。它們對(duì)包涵體氫鍵有較強(qiáng)的可逆性變性作用,，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M,。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱,，溶解度為70-90%，尿素在作用時(shí)間較長(zhǎng)或溫度較高時(shí)會(huì)裂解形成氰酸鹽,，對(duì)重組蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行共價(jià)修飾,，但用尿素溶解具有不電離，呈中性,，成本低,，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去不會(huì)造成大量蛋白質(zhì)沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點(diǎn)，故目前已被廣泛采用。
鹽酸胍溶解能力達(dá)95%以上,，且溶解作用快而不造成重組蛋白質(zhì)的共價(jià)修飾,。但它也有成本高、在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀,、復(fù)性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀和對(duì)蛋白質(zhì)離子交換色譜有干擾等缺點(diǎn),。
8M尿素溶解的包涵體溶液應(yīng)如何保存?
在4度放置半個(gè)月,，都沒(méi)什么問(wèn)題,。在室溫放置超過(guò)48小時(shí)，可能會(huì)對(duì)目的蛋白有影響,，因?yàn)槟蛩卦趬A性條件下可使一些氨基酸?；栽缧┨幚鞡I溶液比較好,。
復(fù)性時(shí)的蛋白濃度是,？
一般使用濃度為0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉淀,，太低的濃度不經(jīng)濟(jì),，而且很多蛋白在低濃度時(shí)不穩(wěn)定，很容易變性,。
蛋白復(fù)性后濃度低
蛋白可能是在復(fù)性的過(guò)程中發(fā)生降解了,。
可以將復(fù)性好的蛋白濃縮一下跑膠看看。復(fù)性過(guò)程一般都是低濃度蛋白,，需要保證分子間有足夠的折疊空間,。一些未正確折疊的蛋白就存在于沉淀中，可能沉淀看不出來(lái),，復(fù)性后的蛋白高速離心看看,。
復(fù)性中蛋白析出是怎么回事？該怎么處理,？
出現(xiàn)蛋白析出,，肯定是條件變化太劇烈了。
復(fù)性應(yīng)該采取復(fù)性液濃度和PH值逐漸變化的方法,，例如根據(jù)包涵體的溶液成分,，每隔1個(gè)PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常,。此外透析時(shí)必須濃度極低,，條件溫和，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊,。但是復(fù)性的比率應(yīng)該很低,。
若加變性劑尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M；
另外可將甘油濃度增加,，范圍可在≤30%,，且在復(fù)性樣品中也可加適量甘油。
復(fù)性效果的檢測(cè)
根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要,，可以從生化,、免疫、物理性質(zhì)等方面對(duì)蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測(cè),。
1,，凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測(cè)變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對(duì)情況,。
2,，光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜,、圓二色性光譜（CD）等,，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測(cè)，但一般只用于復(fù)性研究中的過(guò)程檢測(cè),。
3,，色譜方法：如IEX、RP-HPLC,、CE等,，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同，
4,，生物學(xué)活性及比活測(cè)定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測(cè)定,，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是,，不同的測(cè)活方法測(cè)得的結(jié)果不同,，而且常常不能*反映體內(nèi)活性。
5,，黏度和濁度測(cè)定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加,，變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差,，大多形成可見(jiàn)的沉淀析出,。
6，免疫學(xué)方法：如ELISA,、WESTERN等,，特別是對(duì)結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗(yàn)，比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài),。
變性的融合蛋白可以制備多抗或者單抗嗎,？
變性蛋白只是天然蛋白伸直的了產(chǎn)物,，用來(lái)免疫動(dòng)物具有更強(qiáng)的抗原性。只是天然蛋白中被包在內(nèi)部的抗原決定簇也會(huì)暴露出來(lái),，如果用該變性抗原制備的抗體來(lái)檢測(cè)變性抗原是可以的,，如果用來(lái)檢測(cè)天然蛋白，可能會(huì)有假陽(yáng)性,。做單抗也可以,，同樣道理，篩選出的單抗可能對(duì)抗的抗原決定簇處于天然抗原的內(nèi)部,，是否能用還要看將來(lái)該單抗用來(lái)干什么,。
純化后的可溶性融合蛋白可以直接用于制備多抗嗎？
免疫動(dòng)物要求抗原體種盡量小,。在這種小體積的情況下,，緩沖液里的小分子成分只要沒(méi)毒影響就不大,，可以不用考慮,。