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單抗制備流程
1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合,，形成的雜交細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體,，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù),。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開創(chuàng)了新紀(jì)元,，也為臨床疾病的診、防,、治提供了新的工具,。
制備單克隆抗體包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合,、選擇雜交瘤,、檢測(cè)抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化,、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn),，要經(jīng)過幾個(gè)月的一系列實(shí)驗(yàn)步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序,，逐一介紹其實(shí)驗(yàn)方法,。
一、細(xì)胞融合前準(zhǔn)備
(一) 免疫方案
選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功,，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要,。一般要在融合前兩個(gè)月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定,。
1.顆粒性抗原免疫性較強(qiáng),，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:
初次免疫 1×10７／0.5ml ip (腹腔內(nèi)注射)
↓ 2～3周后
第二次免疫 1×10７／0.5ml ip
↓ 3周后
加強(qiáng)免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(靜脈內(nèi)注射)
↓
取脾融合
2.可溶性抗原免疫原性弱,，一般要加佐劑,，常用佐劑：福氏*佐劑,，福氏不*佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起,，研磨成油包水的乳糜狀,，放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。商品化福氏*佐劑在使用前須振搖,，使沉淀的分枝桿菌充分混勻,。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏*佐劑皮下多點(diǎn)注射
│ (一般0.8～1ml 0.2ml／點(diǎn))
↓3周后
第二次免疫 劑量同上，加福氏不*佐劑皮下或ip
│ (ip劑量不宜超過0.5ml)
↓3周后
第三次免疫 劑量同上,，不加佐劑,，ip
│ (5～7天后采血測(cè)其效價(jià)，檢測(cè)免疫效果)
↓2～3周后
加強(qiáng)免疫,，劑量50～500μg為宜,，ip或iv
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新,，如①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷环矫嬖鰪?qiáng)了抗原的免疫原性,，另一方面可降低抗原的使用量,。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射,。③使用細(xì)胞因子作為佐劑,，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)抗原反應(yīng)性,。
(二) 飼養(yǎng)細(xì)胞
在制備單克隆抗體過程中,，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選,、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中,，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(較為常用),、小鼠脾臟細(xì)胞或小鼠胸腺細(xì)胞,，也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞，使用比較方便,，照射后可放入液氮罐長期保存,，隨用隨復(fù)蘇。
小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備
小鼠采用與免疫小鼠相同的品系,，常用BaLb／c小鼠6～10周齡
↓
拉頸處死 浸泡于75％酒精,，消毒3～5分鐘
↓
用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜
↓
用無菌注射器注入6～8ml培養(yǎng)液
↓
反復(fù)沖洗，吸出沖洗液
↓
放入10ml離心管,，1200轉(zhuǎn)／分離心5～6分鐘
↓
用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液混懸,，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1×10５／ml
↓
加入96孔板，100μl／孔
↓
放入37℃ CO2孵箱培養(yǎng)
一般飼養(yǎng)細(xì)胞在融合前一天制備,，一只小鼠可獲得5～8×106腹腔巨噬細(xì)胞,，若用小鼠胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞濃度為5×106／ml,，小鼠脾細(xì)胞為1×106／ml,，小鼠的成纖維細(xì)胞(3T3)1×105／ml，均為100μl／孔,。
(三) 骨髓瘤細(xì)胞
骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系,，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量 McAb,。
常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1,、SP2／0、X63 Ag8.653等,。
骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液,，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基,。小牛血清的濃度一般在10～20％，細(xì)胞的zui大密度不得超10６／ml,，一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1∶10稀釋傳代,，每3～5天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為16～20小時(shí),，上述三株骨髓瘤細(xì)胞系均為懸浮或輕微貼壁生長,，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細(xì)胞。
一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞,，為確保該細(xì)胞對(duì)HAT的敏感性,，每3～6月應(yīng)用8～AG(8氮雜鳥嘌呤)篩選一次，以防止細(xì)胞的突變,。
保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期,，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95％,，也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵,。
(四) 免疫脾細(xì)胞
免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞棗漿母細(xì)胞。一般取zui后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟,，制備成細(xì)胞懸液,，由于此時(shí)B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合的成功率較高。
脾細(xì)胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾臟,，用不*的培養(yǎng)液洗一次,，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù),。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的２倍,，細(xì)胞數(shù)為２×10８左右。
二,、細(xì)胞融合,，選擇雜交瘤
(一) 細(xì)胞融合流程
(1) 取對(duì)數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞SP2／0，1000rpm離心5分鐘,，棄上清,，用不*培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù),，用不*培養(yǎng)液洗滌2次,。
(2) 同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不*培養(yǎng)液洗滌2次,。
(3) 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起,，在50ml塑料離心管內(nèi)用不*培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘,。
(4) 棄上清,，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度,。
(5) 輕輕彈擊離心管底,，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。
(6) 在室溫下融合:
① 30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO,，邊加邊攪拌,。
② 作用90秒鐘，若冬天室溫較低時(shí)可延長至120秒鐘,。
③ 加預(yù)熱的不*培養(yǎng)液,，終止PEG作用，每隔２分鐘分別加入1ml,，2ml,，3ml，4ml,，5ml和10ml,。
(7) 離心，800rpm,，6分鐘,。
(8) 棄上清,，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打,，以免使融合在一起的細(xì)胞散開,。
(9) 根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加*培養(yǎng)液,，10ml一塊96孔板,。
(10) 將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，100μl／孔,，37℃,、5％CO2孵箱培養(yǎng)。
一般一塊96孔板含有1×107脾細(xì)胞,。
(二) HAT選擇雜交瘤
應(yīng)用HAT 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細(xì)胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到,，這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時(shí)間和濃度。
一般在融合24小時(shí)后,，加HAT選擇培養(yǎng)液,。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時(shí)1ml加入50ml20％小牛血清*培養(yǎng)液中,。
因?yàn)樵谂囵B(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細(xì)胞,、融合后的細(xì)胞，200μl／孔,。所以在加選擇培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)加3倍量的HAT,。我們認(rèn)為，融合后zui初補(bǔ)加的量可用全量的2／3進(jìn)行選擇,，可得到滿意的篩選結(jié)果,。
50×HAT
H: 5×10-3M
A: 2×10-5M
T: 8×10-4M
一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液,，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液,。
三,、抗體的檢測(cè)
篩選雜交瘤細(xì)胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對(duì)免疫原的特異性抗體,。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1／10面積時(shí),，即可開始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系,。檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì),、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法,，一般以快速,、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則,。
常用的方法有:
1. ELISA用于可溶性抗原(蛋白質(zhì)),、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測(cè)。
2. RIA用于可溶性抗原,、細(xì)胞McAb的檢測(cè),。
3. FACS(熒光激活細(xì)胞分類儀)用于檢查細(xì)胞表面抗原的McAb檢測(cè)。
4. IFA用于細(xì)胞和病毒McAb的檢測(cè),。
上述方法均為一般實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法,，故在此不介紹具體的實(shí)驗(yàn)過程。
可靠的篩選方法必須在融合前建立,，避免由于方法不當(dāng)貽誤整個(gè)篩選時(shí)機(jī),。
四、雜交瘤的克隆化和凍存
克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化,。犚r為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆,。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆,，可能包括抗體分泌細(xì)胞,、抗體非分泌細(xì)胞；所需要的抗體(特異性抗體)分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體分泌細(xì)胞,。要想將這些細(xì)胞彼此分開,，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是,，對(duì)于檢測(cè)抗體陽性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制,，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快,，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆,，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失,，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。
(一) 克隆化方案
用克隆化的方法很多,，而zui常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法,。
1. 有限稀釋法的程序
① 制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液(同融合前準(zhǔn)備)
② 陽性孔細(xì)胞的計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1～5×10３／ml
③ 取130個(gè)細(xì)胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞*培養(yǎng)液,，即20個(gè)細(xì)胞／ml,，100μl／孔加A、B,、C三排為每孔2個(gè)細(xì)胞,。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的*培養(yǎng)液,細(xì)胞數(shù)為10個(gè)／ml,，100μl／孔加D、E,、F三排,，為每孔1個(gè)細(xì)胞。余下2.2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的*培養(yǎng)液,，細(xì)胞數(shù)5個(gè)／ml,，100μl／孔，加G,、H兩排,，為每孔0.5個(gè)細(xì)胞。
④ 培養(yǎng)4～5天后,，在倒置顯微鏡上可見到小的細(xì)胞克隆,，補(bǔ)加*培養(yǎng)液200μl／孔。
⑤ 第8～9天時(shí),，肉眼可見細(xì)胞克隆,，及時(shí)進(jìn)行抗體檢測(cè)。
注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在*培養(yǎng)液中加HT,。
2. 軟瓊脂法
① 軟瓊脂的配制
含20％FCS(小牛血清)的2倍濃縮的RPMI1640
1％瓊脂水溶液：高壓滅菌,，42℃預(yù)熱。
0.5％瓊脂：由1份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成,。置42℃保溫,。
② 用上述0.5％瓊脂液(含有飼養(yǎng)細(xì)胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用,。
③ 按100／ml,，500／ml或5000／ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。
④ 1ml 0.5％瓊脂液(42℃預(yù)熱)在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合,。
⑤ 混勻后立即傾注于瓊脂基底層上,，在室溫中10分鐘，使其凝固,，孵育于37℃,，5％CO2孵箱中。
⑥ 4～5天后即可見針尖大小白色克隆,，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板中進(jìn)行培養(yǎng),。
⑦ 檢測(cè)抗體,，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要時(shí)再克隆化,。
(二) 雜交瘤細(xì)胞的凍存
及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞,、每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的,。因?yàn)樵跊]有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染,、分泌抗體能力的喪失等等,。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則因?yàn)樯鲜龅囊馔舛ΡM棄,。
雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣,，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對(duì)原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變,，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),，當(dāng)長滿孔底時(shí)，一孔就可以凍一支安瓿,。
細(xì)胞凍存液:
50％小牛血清
40％不*培養(yǎng)液
10％ DMSO(二甲亞砜)
凍存液預(yù)冷,，操作動(dòng)作輕柔、迅速,。凍存時(shí)從室溫可立即降到0℃,，再降溫時(shí)一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中,?；蚣?xì)胞管降至0℃ 后放-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中,。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存,。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性,，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長時(shí)間,。
五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)
大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：
1. 體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞,，從上清中獲取單克隆抗體,。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg／ml,，如果大量生產(chǎn),，費(fèi)用較高。
2. 體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞,，制備腹水或血清,。
① 實(shí)體瘤法 對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共2～4點(diǎn),。待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般10～20天)則可采血,，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1-10mg／ml。但采血量有限,。
② 腹水的制備 常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石臘于BaLb／c鼠,，1～2周后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞,，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象,，待腹水盡可能多,，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠,，用滴管將腹水吸入試管中,，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水,，可反復(fù)收集數(shù)次,。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml， 這是目前zui常用的方法,，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來,，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多,。
六,、單克隆抗體的鑒定
對(duì)制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對(duì)其做如下方面的鑒定:
1. 抗體特異性的鑒定：除用免疫原(抗原)進(jìn)行抗體的檢測(cè)外,，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn),，方法可用ELISA、IFA法,。例如①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb,，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng),，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體,。② 制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng),，其次是與其它細(xì)胞因子間有無交叉,。
2. McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時(shí)，已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型,。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM,，則檢測(cè)出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來確定McAb的亞類,。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時(shí),，如加入適量的PEG(3％)，將有利于沉淀線的形成,。
3. McAb中和活性的鑒定：用動(dòng)物的或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來確定McAb的生物學(xué)活性,。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，來觀察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù),。
4. McAb識(shí)別抗原表位的鑒定：用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、測(cè)相加指數(shù)的方法,，測(cè)定McAb所識(shí)別抗原位點(diǎn),，來確定McAb的識(shí)別的表位是否相同。
5. McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力,。
七,、影響因素、失敗原因分析
由于制備McAb的實(shí)驗(yàn)周期長,，環(huán)節(jié)多,，所以影響因素就比較多，稍不注意就會(huì)造成失敗,。
其主要失敗原因和影響因素有:
1. 污染：包括細(xì)菌,、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中zui辣手的問題,。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之,，以免污染整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清,，此外,，其它添加劑、實(shí)驗(yàn)室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染,。在有條件的實(shí)驗(yàn)室,，要對(duì)每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時(shí)采取措施處理,。對(duì)于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過濾方法,，將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長出腹水或?qū)嶓w瘤時(shí),，犖^菌取出分離雜交瘤細(xì)胞,，一般可除去支原體污染。
2. 融合后雜交瘤不生長：在保證融合技術(shù)沒有問題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時(shí)間過長,。②牛血清的質(zhì)量太差,，用前沒有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選。③骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體,。④HAT有問題,，主要是A含量過高或HT含量不足。
3. 雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體
① 融合后有細(xì)胞生長,，但無抗體產(chǎn)生,，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A抵抗細(xì)胞所致,。
② 有可能是免疫原抗原性弱,，免疫效果不好,。
③ 對(duì)于原分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮裕赡苁羌?xì)胞支原體污染,，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競(jìng)爭(zhēng)性生長,，從而抑制了抗體分泌細(xì)胞的生長。也可能發(fā)生染色體丟失,。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”,，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。
三要:
要大量保持和補(bǔ)充液氮凍存的細(xì)胞原管,。
要應(yīng)用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細(xì)胞的生長狀況,。
要定期進(jìn)行再克隆。
三不要:
不要讓細(xì)胞“過度生長”,。因?yàn)榉欠置诘碾s交瘤細(xì)胞將成為優(yōu)勢(shì),，壓倒分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。
不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個(gè)月,。
不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機(jī)體內(nèi)以腫瘤生長形式連續(xù)傳好幾代,。
4. 雜交瘤細(xì)胞難以克隆化
可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細(xì)胞的活性狀態(tài)有關(guān),，或由于細(xì)胞有支原體污染,，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化,，應(yīng)在培養(yǎng)液加HT,。