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流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中的常見問題及其解決方法
本文匯總了流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中常見問題（無法標(biāo)記、PE抗體檢測(cè)不到但FITC可檢測(cè)到,、非特異性染色,、熒光強(qiáng)度弱、散射光信號(hào)異常,、結(jié)果與預(yù)期相反等），并給出了各種可能的原因以及對(duì)應(yīng)的解決方法,，希望對(duì)您實(shí)驗(yàn)有所幫助,。
一、細(xì)胞無法標(biāo)記
1．確保所有的抗體都按照廠商的說明書正確存儲(chǔ),。
2．確保商品化抗體沒有超過有效期,。
3．確保已正確加入足量的抗體。
4．確?？贵w已連接熒光素,。如果未連接熒光素，需加入連接有熒光素的二抗,。
5．確保二抗是好的,，也就是說二抗曾經(jīng)能與另外的一抗成功結(jié)合。
6．確保使用了正確的二抗,，就是說二抗能夠識(shí)別你的一抗,。
如果使用的是PE或APC熒光素的抗體，確保該抗體未被冰凍過,。
你要檢測(cè)的組織上是否表達(dá)該抗原,？可查看相關(guān)文獻(xiàn)了解該抗原的表達(dá)情況，或者同時(shí)做一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照,。
抗體是否能識(shí)別檢測(cè)物種的抗原位點(diǎn),？可檢查抗體的交叉反應(yīng)列表,，看看抗體是否適用于你要檢測(cè)的物種標(biāo)本。不是所有的抗體都能夠檢測(cè)所有物種相應(yīng)抗原,。 7．確保使用正確的激光來激發(fā)熒光素,，并使用了正確的通道來檢測(cè)該熒光。
二,、PE抗體無法標(biāo)記,，而FITC抗體的結(jié)果卻很好
1．PE熒光素可能冰凍過。如果冰凍過,，建議另外買一管新的抗體,。
2．多聚甲醛（PFA）可能會(huì)導(dǎo)致此問題。PFA降解后可釋放出甲醇,，從而影響染色,。所以切記PFA盡可能新鮮配制，或者細(xì)胞盡可能不要固定,，染完色就立即檢測(cè),。
三、非特異性染色
1．非特異性染色可能是由于自發(fā)熒光,。
解決方法：用一管只加細(xì)胞不加抗體的空白管,，查看細(xì)胞自發(fā)熒光水平。
某些細(xì)胞可表達(dá)低親和力的Fc受體CD16/CD32,，這種受體可通過Fc片段結(jié)合大多數(shù)抗體,。對(duì)于小鼠細(xì)胞，可使用SeroBlockFcR阻斷該位點(diǎn),。
2．非特異性染色也可能是由于二抗引起,，建議選擇一種只與一抗反應(yīng)、卻不會(huì)與檢測(cè)組織發(fā)生交叉反應(yīng)的二抗,。 確保洗滌充分,。
3．小心滴定抗體。降低抗體濃度可減少非特異性染色,。
四,、熒光強(qiáng)度弱
1．熒光弱可能是由于抗體過度稀釋。因此使用前通過正確滴定抗體,，以確?？贵w濃度適當(dāng)。
2．直標(biāo)時(shí),，熒光弱也可能是由于前帶現(xiàn)象引起（概念見表格后解釋）,，因此，小心正確滴定抗體很有必要。
3．熒光弱可能由于細(xì)胞數(shù)量過多,。建議正確調(diào)整細(xì)胞密度,，一般低于1×10E7/ml。
4．熒光弱可能是由于抗原本身就表達(dá)低,，可通過查閱文獻(xiàn),，明確抗原表達(dá)水平。
5．如果查閱到該抗原確實(shí)本身表達(dá)弱,，那么建議選擇更亮的熒光素,。
6．在交叉反應(yīng)明顯的抗體中，其熒光強(qiáng)度弱于特異性高的單克隆抗體,。
7．一抗或二抗的孵育時(shí)間和溫度均需優(yōu)化,。 散射光異常
8．確保細(xì)胞是新鮮收集的，否則容易出現(xiàn)大量死細(xì)胞和碎片,。
9．對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激,、活化時(shí)，可影響細(xì)胞散射光特性,。
10．如果要裂解紅細(xì)胞,，確保裂解液新鮮配制并且配制正確。
五,、結(jié)果與預(yù)期的相反
1．有些試劑可能會(huì)影響某些抗原檢測(cè),，例如EDTA可影響一些血小板標(biāo)記的檢測(cè)。
2．裂解液也可以影響一些抗原檢測(cè),，此時(shí)可采用PBMC提取法試試,。
3．有些抗原是表達(dá)在胞內(nèi)的，故需選擇正確的破膜劑進(jìn)行正確的破膜處理,。
前帶現(xiàn)象：1929年Heidelberger利用等量抗體檢測(cè)濃度遞增抗原，當(dāng)抗原濃度較低,，抗體濃度相對(duì)較高時(shí),，沉淀反應(yīng)不明顯；當(dāng)抗原濃度增加到與抗體濃度比例合適時(shí),，沉淀反應(yīng)明顯,；繼續(xù)增加抗原濃度時(shí)，沉淀反應(yīng)反而減弱,。據(jù)此繪出雙相應(yīng)答曲線,，曲線高峰區(qū)域，抗體,、抗原濃度呈zui適比,，沉淀反應(yīng)明顯，稱等價(jià)帶,。高峰區(qū)域左側(cè),，由于抗體濃度過高,，沉淀反應(yīng)不明顯，稱前帶,；高峰區(qū)域右側(cè),。由于抗原濃度過高，沉淀反應(yīng)也不明顯,，稱后帶,。抗體濃度過高所致結(jié)果稱前帶現(xiàn)象,，抗原濃度過高所致結(jié)果稱后帶現(xiàn)象,，統(tǒng)稱為帶現(xiàn)象。1977年Green把此現(xiàn)象稱為鉤狀效應(yīng)(hook effect),，包括了前后帶現(xiàn)象,。