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基因工程實(shí)驗(yàn)報(bào)告的實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)一：大腸桿菌DH5α和BL21感受態(tài)細(xì)胞的制備
【實(shí)驗(yàn)步驟】
1 從LB平板上挑取新活化的大腸桿菌DH5α單菌落，接種到5mL LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜,。
2 取1mL培養(yǎng)物接種到100mL LB培養(yǎng)基（250mL三角瓶）中，37℃振蕩培養(yǎng)2~3h,。 3 將菌液轉(zhuǎn)移到50mL離心管（2管）中,，冰上放置15min。 4 4℃ 4000 rpm 離心5min,，棄去上清液,，倒置使培養(yǎng)液流盡,。
5 用20 mL 冷CaCl2溶液懸浮菌體沉淀合并成一管，在4℃ 4000 rpm 離心5min,，棄去上清液,。
6 用10 mL 冷CaCl2溶液懸浮菌體沉淀，冰浴30min,。
7 4℃ 4000 rpm 離心5min,，棄去上清液，用2 mL的冷CaCl2溶液懸浮,。 8 分裝到數(shù)個(gè)EP管中,，每管200 uL，冷凍保存?zhèn)溆谩?nbsp;
實(shí)驗(yàn)二：目的基因質(zhì)粒（T-SOD或T-IL218）
和表達(dá)載體質(zhì)粒（PET32或PET30）的轉(zhuǎn)化及大量提取
【實(shí)驗(yàn)步驟】
一,、載體的轉(zhuǎn)化（無(wú)菌條件,，冰上進(jìn)行） 1、取200 uL 新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞,，分別加入質(zhì)粒DNA 2 uL（PET32a,，IL-18），混勻,，冰上放置30min,。
2、將EP管放到42℃ 保溫90s,，冰浴 2min,。
3、加入800uL LB液體培養(yǎng)基,，37℃慢搖復(fù)蘇1 h,。
4、將100 uL 的復(fù)蘇細(xì)胞涂布在含有Amp（100mg/mL）的LB培養(yǎng)皿中,，正置平皿30min（使菌液被培養(yǎng)基吸收）,。
5、倒置平皿37℃培養(yǎng)16 h,，出現(xiàn)菌落,。 二、質(zhì)粒的提取
1 挑取單菌落接種于100 mL 加入50uL Amp 的LB液體培養(yǎng)基中,，振蕩培養(yǎng)過夜,。
2 過夜培養(yǎng)的菌液加入1.5 mL的小指管（20個(gè)每組）中，每次1 mL,，4℃,，12000 rpm，離心1min，4次,，棄上清,。
3 加入150uL溶液Ⅰ懸浮細(xì)胞，漩渦振蕩,，室溫靜置10min。
4 加入350uL溶液Ⅱ（新鮮配制）,，輕微顛倒混勻20次,，冰浴5min。（不能再劇烈震蕩） 5 加入300uL溶液Ⅲ（冰上預(yù)冷）,，顛倒混勻20次,，不能劇烈震蕩，冰浴10min,。 6 4℃,，12000 rpm，離心10 min,，取上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中,。 7 向上清中加入0.6倍異丙醇，輕輕混勻,，室溫靜置20 min,。
8 4℃，12000 rpm,，離心10 min,，棄上清，倒扣于吸水紙上,，吸凈液體,。
9 用1mL 70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀2次，每次4℃,，12000 rpm,，離心3min，吸去上清,。 10 55℃烘干至無(wú)酒精,，加入20uL TE，所有集成一管后加入RNase 1~2uL,，37℃消化1~2h,，-20℃保存。
11 電泳分析,。制膠：0.14g瓊脂糖,，20mL 1×TBE緩沖液，溶解后倒入制膠板,，放入梳子，冷卻凝固待用,。點(diǎn)樣：6uL質(zhì)粒+1uL上樣緩沖液。電壓：180V,，電泳至藍(lán)色帶距離點(diǎn)樣孔3cm
實(shí)驗(yàn)三 目的基因質(zhì)粒和表達(dá)載體質(zhì)粒的酶切及其產(chǎn)物的分離純化
【實(shí)驗(yàn)步驟】
1 酶切
酶切體系
試劑 小量酶切 大量酶切
滅菌水 5uL —
質(zhì)粒 10uL 88uL
EcoRⅠ 0.5uL 1uL
HindⅢ 0.5uL 1uL
10×Tango buffer 4uL 10uL
終體積 20uL 100uL
按以上酶切體系加入0.5 mL EP管中,，37℃放置3h，電泳回收片段,。 （點(diǎn)樣：酶切體系100uL+上樣緩沖液20uL,。）
2 酶切產(chǎn)物的回收
1) 將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分放入干凈的離心管中，
稱取重量,。
2) 向膠塊中加入3倍體積溶膠液（如果凝膠重為0.1g,，其體積可視為100uL，則加入300uL
溶膠液）,，50-55℃水浴放置10min,，期間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解,。
注意：溶膠時(shí),，如果溶膠液變?yōu)榧t色（正常情況下為淡黃色），可向含有DNA的膠溶液中加10-30uL 3N醋酸鈉（pH5.2）將溶液調(diào)為淡黃色,，否則將會(huì)影響DNA與吸附柱的結(jié)合,，影響回收效果。
3) 將上一步所得的溶液加入一個(gè)吸附柱中（吸附柱放入收集管中）,，13,，000rpm 離心
30-60s，倒掉收集管中的廢液,，將吸附柱重新放入收集管中,。
注意：膠塊*溶解后將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因?yàn)槲街谳^高溫度時(shí)結(jié)合DNA的能力較弱,。
4) 向吸附柱中加入700uL漂洗液（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇）,，13，000rpm 離
心30-60s,，倒掉廢液,，將吸附柱重新放入收集管中。
5) 向吸附柱中加入500uL漂洗液,，13,，000rpm 離心30-60s，倒掉廢液,。
6) 將離心吸附柱放回收集管中,，13，000rpm 離心2min，盡量出去漂洗液,，將吸附柱開蓋
于室溫1-2min,，*晾干，防止殘留的漂洗液影響下一步的實(shí)驗(yàn),。
7) 將吸附柱放到一個(gè)干凈的離心管中,，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65-70℃預(yù)熱的洗
脫液，室溫放置2min,。13,，000rpm 離心2min收集DNA溶液。 8) DNA產(chǎn)物-20℃保存,。
完畢后電泳檢測(cè)回收與純化效果：DNA回收純化后，電泳檢測(cè)應(yīng)為單一的一條帶,，如果切膠過程中不慎帶上染帶,，回收后電泳結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)兩條以上的帶，這時(shí)應(yīng)重復(fù)上述方法進(jìn)行回收與純化,。
實(shí)驗(yàn)四 目的基因與表達(dá)載體的重組及重組子的篩選與鑒定
【實(shí)驗(yàn)步驟】
1載體與目的基因的連接
1) 在一1.5mL EP管中加入2uL酶切后的載體DNA與6uL目的DNA片段,。 2) 添加1uL的10×buffer以及1uL的T4DNA連接酶，總體積10uL,。 3) 16℃水浴條件下保溫過夜連接,。 2感受態(tài)細(xì)胞與連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 1) 取感受態(tài)細(xì)胞BL21（實(shí)驗(yàn)一制備） 200uL，加入6uL連接產(chǎn)物,，輕輕用槍吹打混勻（不
可震蕩）,。 2) 冰浴30min。
3) 熱激：42℃保溫90S,，冰浴2min,。
4) 加入800ul LB培養(yǎng)基，37℃慢慢復(fù)蘇30min,。
5) 將復(fù)蘇菌液4000r/min離心1min,，先吸去800μL上清，再將細(xì)胞吹散成細(xì)胞懸液,，取
50μL細(xì)胞懸液直接涂布在含氨芐青霉素（Amp）100ug/ml,、X-gal和IPTG的LB選擇平板上。
6) 將平板正向放置30min左右至液體被吸收,，倒置平板37℃培養(yǎng)16—20h出現(xiàn)菌落,，其
中白色為重組質(zhì)粒。
3 重組子的鑒定（藍(lán)白斑篩選,，小提質(zhì)粒比大小和酶切分析）
1）將白色單菌落接入3mL 含抗生素（Amp）的LB液體培養(yǎng)基中,，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。 2）按實(shí)驗(yàn)二的方法提取質(zhì)粒DNA，20uL RTE溶解DNA沉淀,。 3）雙酶切質(zhì)粒DNA 20uL 體系,，方法同上。
4）1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)重組質(zhì)粒和它的酶切產(chǎn)物,。
（酶切鑒定重組子可見重組成功的重組子有兩個(gè)條帶：一為切為線性的PET32a質(zhì)粒條帶,，一為目的基因條帶。）
實(shí)驗(yàn)五 目的基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析
實(shí)驗(yàn)I ,、外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
【實(shí)驗(yàn)步驟】
1. 分別挑取白斑菌落（重組菌株）,、藍(lán)斑菌落（非重組菌株）于5ml 含AMP的LB液體培養(yǎng)基中，37℃,，190r/min振蕩培養(yǎng)過夜(注意取菌株要在超靜工作臺(tái)上操作,，一定注意無(wú)菌)。 2.分別取過夜培養(yǎng)菌1ml接種到5ml含AMP的LB液體培養(yǎng)基中（藍(lán),，白斑各3管,，作好標(biāo)記），于37℃搖床培養(yǎng)4h左右,，達(dá)到1個(gè)OD值,。
3.因?yàn)檎T導(dǎo)劑IPTG的量,誘導(dǎo)條件,誘導(dǎo)時(shí)間，培養(yǎng)基成分都可影響誘導(dǎo)表達(dá),，所以可按如下6組設(shè)計(jì)培養(yǎng)
| 搖瓶時(shí)間（t/h） | IPTG/ul | 溫度T/℃ | 樣液 |
| 5 | 7 | 32 | 白 |
| 5 | 7 | 37 | 白 |
| 5 | 7 | 42 | 白 |
| 5 | 7 | 32 | 藍(lán) |
| 5 | 7 | 37 | 藍(lán) |
| 5 | 7 | 42 | 藍(lán) |
4.分別取 6支試管按上述表格控制條件,搖瓶培養(yǎng)5h,。
5. 取1ml搖瓶后菌液于離心管，共6支,，4℃低溫離心,，12000 r/min，5 min,，收獲菌體,，棄上清，取沉淀（菌體可放-20℃存放備用）,。
6.向每支試管沉淀均加入200μL TE液,，將細(xì)胞懸浮。
7. 每管加入200μL 2 X SDS buffer,。開水煮沸5min,，再冰浴2min，4℃,12000 r/min,，5 min,，取上清液做凝膠電泳。
8.觀測(cè)結(jié)果及分析（實(shí)驗(yàn)Ⅱ）
實(shí)驗(yàn)Ⅱ SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)蛋白
【實(shí)驗(yàn)步驟】
1． 配制分離膠
分離膠配方
雙蒸水 分離膠緩沖液 30%膠貯液 10%SDS TEMED 10%AP
6.7ML 5ML 8ML 200μL 15μL 150μL
①按要求裝好膠板 ②按比例調(diào)好分離膠,，混勻后加入兩玻璃夾縫中,，到上口約2cm處,，并小心在膠面上加入 1cm 蒸餾水，約 40 min,，等膠自然凝聚后傾斜倒,，出蒸餾水，并在兩玻璃板夾縫中水平插入 1.5 mm 的梳子(在膠面上加入蒸餾水稱水封,，其目的是保持膠面平整和防止空氣進(jìn)入,，影響凝膠)。
2.按配方配制好濃縮膠
濃縮膠配方 雙蒸水
濃縮膠緩沖
液 膠貯液 10%SDS TEMED 10%AP 6.1ML 2.5ML 1.3ML 100μL 15μL 75μL
混勻后加入到分離膠上,，并沒過梳子,，待凝固后小心撥出梳子。
3．樣品制備
菌體樣品與 2×上樣緩沖液 l:1 混勻,，并在 100??C 沸水浴中保溫 3-5 min,，取出待用。
4.點(diǎn)樣,，電泳：開始電泳后,，先恒壓80V，樣品進(jìn)入分離膠后恒壓120V,，至電泳帶跑到前沿后停止電泳。
5.固定,、染色,、脫色：電泳完畢，將膠板從電泳槽中取出,，小心從玻璃板上取下凝膠,，將凝膠浸泡于染色液中染色30min左右，zui后加脫色液放到脫色搖床上脫色至區(qū)帶清晰為止,。