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RNA pull dow實(shí)驗(yàn)流程
RNA Pull Down實(shí)驗(yàn)流程
使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針,，然后與胞漿蛋白提取液孵育,，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離,。復(fù)合物洗脫后,，通過western blot實(shí)驗(yàn)檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。 蛋白質(zhì)與RNA的相互作用是許多細(xì)胞功能的核心,，如蛋白質(zhì)合成,、mRNA組裝、病毒復(fù)制,、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控等,。若待檢測目的蛋白明確，選擇Western blot鑒定,；若不明確,，則可選擇質(zhì)譜鑒定。
RNA pull-down是檢測RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)手段之一,。RNA pull-down使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針,，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物,。該復(fù)合物可與鏈親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合,，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后,，通過Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用,。
1) lncRNA篩選：
通過lncRNA芯片或RNA測序等方法對多對疾病模型和對照樣本組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析；
通過生物信息學(xué)的方法篩選出具有表達(dá)差異的lncRNA,，構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),，預(yù)測lncRNA的靶基因；
通過PCR或Northern Blot技術(shù)對候選lncRNA驗(yàn)證,，確定其表達(dá)差異,。
2) lncRNA確定：
通過5' RACE獲取lncRNA 5'全長，3' RACE獲取lncRNA3'全長,，zui終拿到完整的lncRNA序列,。
3) 表達(dá)分析：
細(xì)胞水平表達(dá)：在細(xì)胞水平進(jìn)行檢測表達(dá)差異。 組織分布：檢測不同組織,、不同階段表達(dá)特性,。
表達(dá)水平動(dòng)力學(xué)變化：比較不同處理?xiàng)l件下，如藥物處理,、誘導(dǎo)處理下,，表達(dá)水平差異。
4) 功能研究：
功能獲得性研究：構(gòu)建lncRNA過表達(dá)載體:原則上是將全長lncRNA定向克隆到表達(dá)載體上實(shí)現(xiàn)lncRNA的過表達(dá),。然而有些lncRNA很大或全長尚未分離,，這時(shí)將視lncRNA在基因組上的定位采取不同的研究策略。
功能缺失性研究：可通過siRNA、shRNA,、反義核酸等方法沉默lncRNA,，干預(yù)lncRNA后檢測其對疾病相關(guān)基因表達(dá)的影響和對細(xì)胞表型如增值、凋亡,、侵襲,、轉(zhuǎn)移等的影響；
采用RNA pull down,、RNA-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation),、ChIRP-seq(Chromatin Isolation by RNA Purification)等方法檢測與lncRNA結(jié)合的DNA、RNA,、蛋白質(zhì),。
采用lncRNA芯片分析技術(shù)結(jié)合mRNA對lncRNA功能進(jìn)行預(yù)測，研究lncRNA trans和cis作用機(jī)制,。
采用配體指數(shù)級富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,，SELEX)，設(shè)計(jì)一種RNA配體,，與癌癥相關(guān)的lincRNA結(jié)合達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移,。
采用快速預(yù)測RNA與蛋白質(zhì)相互作用與結(jié)構(gòu)域（catRAPID）在線算法來預(yù)測RNA與蛋白質(zhì)的相互作用，該算法根據(jù)RNA和蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),、氫鍵和分子作用力來評估它們之間的相互作用的傾向,。
采用非編碼RNA沉默和定位分析（c-KLAN）技術(shù)對lncRNA進(jìn)行功能缺失
（Loss-of-function）研究和細(xì)胞定位，該技術(shù)是在基于核糖核酸內(nèi)切酶制備的小干擾RNA（esiRNA）和熒光原位雜交（FISH）2種現(xiàn)有的研究方法的基礎(chǔ)上建立起來的,。
5) 表達(dá)調(diào)控：將lncRNA表達(dá)與其他領(lǐng)域相結(jié)合,，解釋lncRNA調(diào)控機(jī)理。 DNA甲基化：可通過檢測相應(yīng)基因甲基化差異與lncRNA結(jié)合分析,。 轉(zhuǎn)錄因子：研究lncRNA與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制,。 染色質(zhì)重塑：lncRNA表觀調(diào)控。 一.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,、涂板,、搖菌
1.取JM109感受態(tài)細(xì)菌80µl，加入1.5mlEP管中,，用10µl槍頭沾取質(zhì)粒加入上述EP管中，混勻,。
2.冰上靜置30min,。
3.42℃熱休克90-120s。
4.迅速移至冰上靜置2min,。
5.在超凈臺內(nèi),，于上述EP管中加入50µlLB培養(yǎng)基（Amp－），37℃，160rpm搖床,，增菌0.5-1h,。
6.菌液4,000rpm離心10min，棄大部分上清,，將沉淀重懸,，菌液全部加入LB平板（Amp+）上，涂布均勻,，37℃倒置培養(yǎng)（過夜12-15h）,。
7.將37℃培養(yǎng)（12-16h）平板取出，于無菌操作臺中挑取單克隆放入內(nèi)含5mlLB培養(yǎng)基（Amp+）的15ml離心管中,，于37℃,、250rpm搖床增菌過夜18H,看菌液是否渾濁。菌液渾濁后進(jìn)行質(zhì)粒中提,。
二.質(zhì)粒中提（TIANGEN,，DP107-02）
1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500µl的平衡液BL，12,000rpm離心1min,，盡量吸除上清,。
2.取1.5ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中,，使用常規(guī)臺式離心機(jī),，12,000rpm離心1min，盡量吸除上清,。
3.向留有菌體沉淀的離心管中加入250µl溶液P1使用移液器*細(xì)菌沉淀,。
4.向離心管中加入250µl溶液P2，溫和的上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解,。
5.向離心管中加入350µl溶液P3,，立即溫和的上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻,，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀,，12,000rpm，離心10min,，此時(shí)在離心管底部形成沉淀,。
6.將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，12,000rpm,，離心30-60sec,，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中,。
7.向吸附柱CP3中加入500µl去蛋白液PD,，12,000rpm離心,，離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液,，將吸附柱CP3重新放回收集管中,。
8.向吸附柱CP3中加入600µl去蛋白液PW，12,000rpm離心,，離心30-60sec,，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中,。重復(fù)一次,。
9.將吸附柱CP3重新放回收集管中，12000rpm離心2min,。
10.將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中,，向吸附膜的中間部位滴加50µl洗脫緩沖液EB，室溫放置2min,，12,000rpm離心2min,，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中，放冰盒,，測濃度,。
三.質(zhì)粒線性化：
本實(shí)驗(yàn)使用的酶為Biolabs的重組酶KpnⅠ。 酶切后進(jìn)行跑膠,。
四.瓊脂糖凝膠電泳
1.配膠,。成分：瓊脂糖粉、TBE,、ⅠH2O,，少量EB。
2.TBE與H2O混合加入放好瓊脂糖粉的錐形瓶中,，搖勻,，放入微波爐加熱1-2min。
3.滴加少量EB,，于錐形瓶中搖勻,。
4.倒入膠板中，插入梳子,，待瓊脂糖凝固,。
5.小心拔掉梳子，取10µl樣品加入1µl的10×LoadingBuffer緩緩加入點(diǎn)樣孔,，并在zui右邊的點(diǎn)樣孔加5µlDNAmaker,。
6.接通電源。
7.電泳完畢,，關(guān)閉電源,。從膠模中取出瓊脂糖凝膠，于紫外燈下切下目的條帶,。
五.膠回收（TIANGEN,，DP214-02）
1.向吸附柱CB2中加入500µl平衡液BL，12,000rpm離心1min,，倒掉收集管中的廢液,，將吸附柱重新放回收集管中。
2.將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中,，稱取重量,。
3.向膠塊中加入等倍體積溶液PC，50℃水浴放置10min左右,，其間不斷的上下翻轉(zhuǎn)離心管,，以確保膠塊充分溶解。
4.將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱CB2中12,000rpm離心1min,，倒掉收集管中的廢液,，將吸附柱CB2放入收集管中。
5.向吸附柱CB2中加入600µl漂洗液PW,，12,000rpm離心1min,，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中,。
6.重復(fù)操作步驟⑤,。
7.將吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm離心2min,，盡量除去漂洗液,。將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，*晾干,。
8.將吸附柱CB2放入一個(gè)干凈的離心管中,，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液EB，室溫放置2min,，12,000rpm離心2min,，收集DNA溶液。
六.轉(zhuǎn)錄以及生物素標(biāo)記：
1.取無RNA酶管,，按下表操作：
2.取出孵育好的EP管,，加入2µl的DNaseⅠ，37℃孵育15min以除去體系中的DNA,。
3.取出上述操作的EP管,，加入2µl0.2MEDTA（pH=8.0）終止反應(yīng)。
4.取1µgBiotin標(biāo)記的RNA,，加入適量StructureBuffer,使得RNA形成二級結(jié)構(gòu),。然后將RNA95℃加熱2min,，冰浴3min，室溫靜置30min,。
5.磁珠準(zhǔn)備：使用RIPWashBuffer500µl沖洗磁珠3次,。
6.用50µlRIPWashBuffer重懸磁珠，然后將其加入到生物素標(biāo)記并變性的RNA中,，4℃過夜,。
7.過夜的混合物3000rpm離心1min，去上清,。
8.RIPWashBuffer沖洗3次,，切記將液體沿壁加入或者滴加，上下緩慢翻轉(zhuǎn)混勻,，切勿用移液器吹打,。
9.往磁珠-RNA混合物中加入細(xì)胞裂解液，裂解液中加入適量RNase抑制劑,，室溫放置1h,。
10.將孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速離心，上清回收,，使用RIPWashBuffer沖洗3次,，1次1ml。
11.于樣品中加5×SDS上樣緩沖液,，95℃變性10min,，跑SDS-PAGE凝膠。
12.考染：取出SDS-PAGE凝膠于考馬斯亮藍(lán)染色液中,，搖床過夜,。次日用考馬斯亮藍(lán)脫色液脫色1~2h，中間更換幾次脫色液至條帶清晰,，背景低為止,。 13.將目的條帶切下送測序(質(zhì)譜檢測)。
問題1：RNA降解
可能原因：
1）無核酸酶的環(huán)境被破壞
2）體外轉(zhuǎn)錄的RNA探針降解
解決辦法：
1）清洗和使用新開的離心管和試劑等
2）RNA探針合成后,，電泳檢測其長度和濃度
問題2：RNA結(jié)合蛋白的親和力不夠：
可能原因：
1）結(jié)合緩沖環(huán)境沒有優(yōu)化
2）裂解不*
3）磁珠用量不足
4）RNA探針用量不足
解決辦法：
- 優(yōu)化孵育時(shí)間,、溫度、鹽濃度等條件
- 增加裂解液和蛋白上樣量的比例
- 增加裂解液
- 增加磁珠用量
- 增加探針用量
- 確定生物素和鏈霉親和素效率
問題3：RNA結(jié)合蛋白沒有結(jié)合
可能原因：
1）靶蛋白量不足
2）緩沖體系不對
3）RNA探針和蛋白的親和力本來就低
解決辦法：
- 增加上樣蛋白量
- 應(yīng)用低鹽體系
- 加入交聯(lián)試劑
問題4：結(jié)合的非特異性高
可能原因：
1）緩沖環(huán)境沒有優(yōu)化
2）緩沖環(huán)境嚴(yán)謹(jǐn)性低
3）樣品沒有裂解*和裂解體系沒有優(yōu)化
解決方法：
1）優(yōu)化孵育時(shí)間溫度鹽濃度等條件
2）使用嚴(yán)謹(jǐn)性高的緩沖體系
3）調(diào)低RNA探針和樣品的比例
4）提高裂解液的量
問題5：WB信噪比高
可能原因：
1）陽性信號率低
2）一抗效率低
3）蛋白沒有充分溶解
解決方法：
1）增加二抗的量
2）用敏感度的化學(xué)發(fā)光液
3）用細(xì)胞裂解液預(yù)孵一抗
4）增加樣品的量
5）確定有沒有其他可能的結(jié)合情況
6）增加裂解液用量