您好, 歡迎來到化工儀器網
12
親和色譜法及其在我國的研究發(fā)展狀況
親和色譜也稱為親和層析,，是一種利用固定相的結合特性來分離分子的色譜方法。技術蓬勃發(fā)展，中國色譜專家同時也非常注重間色譜技術的交流,。隨著間交流加深,，中國的色譜技術已經跟上了世界的步伐。色譜與生命科學的交叉研究,、色譜與其它分析技術的聯(lián)用表現(xiàn)得異?；钴S。
1．親和色譜
1.1色譜概述
20世紀初,，俄植物學家茨維特提出色譜法,。他把碳酸鈣粉末裝到玻璃管中，將植物葉子的石油醚萃取液作為樣品倒入管內,，然后再用石油醚自上而下洗脫,。隨著洗脫的進行，植物葉子中的各種色素向下移動逐漸形成一圈圈的色帶,，茨維特將這種色帶分離過程稱為色譜,，所用的玻璃管內的碳酸鈣填充物稱為固定相,洗脫用的石油醚稱為洗脫液或洗脫劑，也就是我們常說的流動相,。后來,，采用該法分離了許許多多的物質，雖然分離過程中看不到色帶存在,，但色譜法一直沿用至今,。
色譜法在當今物質尤其是具有生物活性物質的分離中起到舉足輕重的作用。然而在色譜發(fā)展的早期有許多的人往往將色譜看做一種藝術, 但是隨著色譜理論的發(fā)展,，以及色譜技術的不斷推廣,，色譜逐漸的稱為了一種科學。對于從事生物大分子分離的物質常常用一句話來形容色譜的重要作用：“色譜技術是當今生物工程下游技術的核心”,。當今的色譜法包括分離和檢查兩部分,，能夠同時實現(xiàn)分離和分析。色譜法也必定會隨著材料,、生物等多學科研究的深入會更加廣泛的應用到分離科學和分析化學之中的,。
將一對能可逆結合和解離生物分子的一方作為配基（也稱為配體），與具有大孔徑,、親水性的固相載體相偶聯(lián),、制成專一的親和吸附劑，再用此親和吸附劑填充色譜柱,，當含有被分離物質的混合物隨著流動相流經色譜柱時,，親和吸附劑上的配基就有選擇地吸附能與其結合的物質,，而其他的蛋白質及雜質不被吸附,，從色譜柱中流出,，使用適當?shù)木彌_液使被分離物質與配基解吸附,，即可獲得純化的目的產物,。在生物體內,，許多大分子具有與某些相對應的專一分子可逆結合的特性。例如抗原和抗體,、酶和底物及輔酶,、激素和受體、RNA和其互補的DNA等,，都具有這種特性,。生物分子之間這種特異的結合能力稱為親和力，根據(jù)生物分子間親和吸附和解離的原理,，建立起來的色譜法,。
在生物體內，許多大分子具有與某些相對應的專一分子可逆結合的特性,。例如抗原和抗體,、酶和底物及輔酶、激素和受體,、RNA和其互補的DNA等,，都具有這種特性。生物分子之間這種特異的結合能力稱為親和力,，根據(jù)生物分子間親和吸附和解離的原理,，建立起來的色譜法稱親色譜法。親和色譜中兩個進行專一結合的分子互稱對方為配基,。如抗原和抗體,，抗原可認為是抗體的配基，反之抗體也可認為是抗原的配基,。將一個水溶性配基在不傷害其生物學功能的情況下與水不溶性載體結合稱為配基的固相化,。 親和色譜法的基本過程是：
1.配基固相化。將與純化對象有專一結合作用的物質,，連接在水不溶性載體上,，制成親和吸附劑后裝柱（稱親和性）。
2.親和吸附,。將含有純化對象的混合物通過親和柱,，純化對象吸附在柱上，其他物質流出色譜柱,。 3.解吸附,。用某種緩沖液或溶液通過親和柱，把吸附在親和柱上的欲純化物質洗脫出來
親和色譜是一種利用固定相的結合特性來分離分子的色譜方法,。親和色譜在凝膠過濾色譜柱上連接與待分離的物質有一定結合能力的分子,，并且它們的結合是可逆的，在改變流動相條件時二者還能相互分離。親和色譜可以用來從混合物中純化或濃縮某一分子,，也可以用來去處或減少混合物中某一分子的含量,。 親和色譜分離的通常是混合在溶液中的物質，比如細胞內容物,、培養(yǎng)基或血漿等,。待分離的分子在通過色譜柱時被固定相或介質上的基團捕獲，而溶液中其他的物質可以順利通過色譜柱,。然后把固態(tài)的基質取出后洗脫,，目標分子即刻被洗脫下來。如果分離的目的是去除溶液中某種分子,，那么只要分子能與介質結合即可,，可以不必進行洗脫。 1.2一般流程
親和色譜分離的通常是混合在溶液中的物質,，比如細胞內容物,、培養(yǎng)基或血漿等。待分離的分子在通過色譜柱時被固定相或介質上的基團捕獲,，而溶液中其他的物質可以順利通過色譜柱,。然后把固態(tài)的基質取出后洗脫，目標分子即刻被洗脫下來,。如果分離的目的是去除溶液中某種分子,，那么只要分子能與介質結合即可，可以不必進行洗脫,。 1.3特殊應用
親和色譜的用途很廣泛,，可以用來從細胞提取物中分離純化核酸、蛋白,，還可以從血漿中分離抗體,。分離重組蛋白就經常使用親和色譜。通過基因修飾為蛋白加上一些人為的特性,，這些特性使蛋白選擇性地與配體結合,，從而達到分離的目的。親和色譜的另一大用途是從血漿中分離抗體,。 1.4影響親和色譜的因素
1.4.1上樣體積
若目標產物與配基的結合作用較強,，上樣體積對親和色譜效果影響較小。若二者間結合力較
弱,，樣品濃度要高一些,，上樣量不要超過色譜柱載量的5%~10%。
1.4.2,、柱長
親和柱的長度需要根據(jù)親和介質的性質確定,。如果親和介質的載量高,，與目標產物的作用力強，
可以選擇較短的珠子,；相反,，則應該增加柱子的長度，保證目標產物與親和介質有充分的作用時間,。
1.4.3,、流速
親和吸附時目標產物與配基之間達到結合反應平衡需要一個緩慢的過程,。因此,，樣品上柱的
流速應盡量的慢，保證目標產物與配基之間有充分的時間結合,，尤其是二者間結合力弱和樣品濃度過高時,。
1.4.4、溫度
溫度效應在親和色譜中比較重要,，親和介質的吸附能力受溫度影響,，可以利用不同的溫度進行吸附和洗脫。一般情況下親和介質的吸附能力隨溫度的升高而下降,，因此在上樣時可選擇較低的溫度,，使待分離物質與配基有較大的親和力，充分地結合,；而在洗脫時刻采用較高的溫度,，使待分離物質與配基的親和力下降，便于待分離物質從配基上脫落,。例如,，一般選擇在4℃進行吸附，25℃下進行洗脫,。
2．研究現(xiàn)狀
膜親和色譜是人們將親和色譜和膜技術結合起來研制的,，以膜為基質的親和色譜，其基本原理是將微濾膜或超濾膜經表面改性活化處理后,，偶聯(lián)上合適的配基,，使固定在膜載體上的配基特異性地與待分離的生物大分子結合成復合物，再經洗脫是生物大分子得以分離純化,。因此親和膜色譜技術即具有膜技術分離快,，處理量大的特點，又具有親和色譜特異性高的優(yōu)點,。目前親和膜色譜法已成為分離純化生物大分子的重要手段之一,。鏈接到膜基質上的配體分為兩大類：生物特異性配體和基團特異性配體，后者又稱為通用性配體,。以此為依據(jù),，可以對膜親和色譜法進行分類,，常見的有生物親和色譜，免疫親和色譜,，金屬螯合親和色譜等,。
生物親和色譜中連接到基質上的配體是存在特異性相互作用的生物大分子，如酶與底物,，酶與抑制劑,，激素與受體等，因而具有高度的選擇性,。但是這類生物大分子通常價格昂貴且不易連接到基質上,，限制了它們在大規(guī)模工業(yè)生產中的應用。
免疫親和色譜是將抗原抗體中的一方連接到基質上來吸附純化另一方的色譜分離技術,。隨著可利用的單克隆抗體技術的發(fā)展,，免疫親和色譜的應用日益廣泛，期工業(yè)化應用前景廣闊,。
金屬螯合親和色譜又稱固定化金屬螯合親和色譜,，是Porath等首先提出來的。在上世紀70年代他們將銅離子,、鋅離子通過螯合劑亞氨基二乙酸交聯(lián)到Agatose上,，利用金屬離子與蛋白質表面組氨酸等的配位作用選擇性的分離對金屬離子有親和里的蛋白質。期理論基礎是不同條件下配位鍵的形成和解離,，即過渡金屬離子(銅,，鐵，鋅,，鎳等)與蛋白質表面的組氨酸,，色氨酸，半胱氨酸等電子供體形成配位復合物,，因而連接上這些金屬離子的載體就能選擇性的吸附含有咪唑基或巰基的肽類或蛋白質,。吸附力的大小在很大程度上取決于蛋白分子表面咪唑基或巰基的稠密程度。此外,，不同的金屬離子對親和力大小也有影響,。80年代，人們又提出用微孔的膜作支撐基質,，充分發(fā)揮了膜過程設備簡單,，易放大，成本低,，分離速度快,，可連續(xù)操作等優(yōu)點，是生物工程產品的工業(yè)化大規(guī)模分離純化得以實現(xiàn),。一,、中國色譜技術的發(fā)展歷程有機高分子方面應用
親和色譜作為液相色譜的一個重要分支,，對于生物大分子的分離純化是有特殊意義的。如果說前面所介紹的幾種色譜方法都是通用性分離技術的話,，那么;23 方法則基本上是屬于專一性的,，前者是根據(jù)溶質分子之間在物理化學性質方面的差異所建立的分離方法，后者則利用了生物分子之間特異性相互作用而實現(xiàn)分離的,。這種特異性相互作用是活性生物大分子固有的特征,，例如酶能與底物、抑制物,、輔酶等結合,，抗體能與互補的抗原相結合，凝集素能與細胞的表面抗原以及某些糖類相結合,，激素能與蛋白及細胞受體形成復合物,，基因可與核酸和阻遏蛋白相互作用等等,。所以,，原則上講，如果在固相載體上連接一種具有生物特異性的配基,，就可以建立一種親和色譜方法,，用于分離與配基相對應的物質。
親和色譜的顯著特點是,，具有其他分離技術所不能比擬的高選擇性,，而且能有效地保持生物大分子結構的穩(wěn)定性，活性樣品的回收率也比較高,，所以這種技術用于純化酶,、抗體、核酸,、輔助因子和各種能識別,、貯存和運載具有生化和藥理作用物質的蛋白質，用于生物樣品解離常數(shù)和平衡常數(shù)以及動力學序列和結合機制的研究等,，都是很有意義的,。
有機高分子類型的AFC填料，按其基質材料,，可分為多糖型和高聚物型兩大類,；按其配體性能即填料所攜帶配體對被分密物質的選擇性特征，可分為性和通用性兩大類,。性填料,，例如基于抗原與抗體、激素與受體蛋白等特異性相互作用的填料,，其配體對于目標化合物有很高的特異選擇性和親和能力,。通用性填料因其配體可與數(shù)種生物分子產生親和作用,，顯然達不到專一的選擇性，但這類配體的種類很多,，價格低廉而容易獲得,，應用范圍非常廣泛，所以在親和色譜中仍處于主導地位,。常見的通用性親和配體,，主要包括金屬螫合配體（如螫合
了Cu2+、Ni2+,、Zn2+ 等金屬離子的配體）,，小分子類配體（如氨基酸、肽類,、明膠,、肝素等），顏料類親和配體,，外源凝集素類親和配體（如刀豆球蛋白A,、扁豆外源凝集素、麥芽外源凝集素等）,、核酸與核苷酸類親和配體,。
從親和配體的連接方式來看，既可以將配體與基質直接偶聯(lián),，也可以在基質與配體之間插入一如適當長度的鏈狀間隔臂,。大量研究表明帶有間隔臂的AFC填料往往具有更為優(yōu)異的色譜性能，由于適當?shù)拈g隔壁鏈段可以有效地克服基質表面的幾何位阻效應,，使得配體更容易與被分離物質相結合,。對于以小分子為配體來分離大分子的親和填料來說，間隔臂的作用就更為重要了,。AFC填料的間隔臂按其結構類型,，主要包括脂肪鏈的烴類、鏈狀的聚胺類,、肽類,、鏈狀聚醚類等。間隔臂有親水性的,，也有疏水性的,，間隔臂鏈段長度則視其結構與性能不同而
異，例如疏水性的脂肪烴類鏈段,，一般為2-10個亞甲基的長度,，過長會因其自身返折而失去作用，也會因其產生強疏水性吸附而對蛋白質的分離不利,。
3．在我國發(fā)展狀況
3.1發(fā)展歷史
新中國成立之后,，色譜技術zui初只應用于石油領域,，到了20世紀60年代，才開始應用于國防領域,。新中國的色譜技術在老一輩色譜科學家的帶領下,，取得了長足的進步：
1954年，盧佩章院士首先把氣-固色譜法的體積色譜成功的應用于水煤氣合成產品的氣體組分分析,；
1956年成功開展氣液的體積色譜成功用于石油產品分析,；
1961年朱葆琳領導丁景群開展了毛細管色譜的研究，并成功地用于石油產品的分析,； 1964年*顆原zi彈爆炸前,，zui后獲得的鈾235金屬中的痕量氣體分析，我國的色譜工作者在1963年1月份就開始本項金屬中痕量氬的測定,，并與年底完成,；
1956-1958年發(fā)表了用液相色譜分析石油，油頁巖和煤焦油組成的結果,，建立了用碘和碘仿作為柱內顯譜劑的快速測定烷,、烯、芳三元組成分析方法樣品用量0.5ml,，分析誤差在1%以內,，平均分析時間為1h，并將分配色譜和紫外光譜聯(lián)合的方法用于分析低沸點酚類的單體組成,；
20世紀60年代后期，現(xiàn)代液相色譜技術獲得飛速發(fā)展,，引起了國內色譜界的重視,，1974年，盧佩章等開始從事液相色譜研究,，針對了當時液相色譜的兩個主要矛盾：一是儀器設備,，二是固定相，開展了微粒型硅膠及其各種化學鍵合相得研究,，并提供了產品供應的國內需求,；
1968-1974年完成核潛艇用船用色譜儀；連續(xù)測定密閉艙中的大量和微量有毒氣體的組成,，確保了潛艇人員在水下長期作業(yè)的生命安全和生活需要,，這也是當時世界的船用色譜儀；
文化大革命后,，隨著改革開放的到來,，中國色譜技術有了高速的發(fā)展，應用領域也在擴大,，主要的應用領域如下：
·石油和石油化工分析：油氣田勘探中的化學分析,、原油分析,、煉廠氣分析、模擬蒸餾,、油料分析,、單質烴分析、含硫/含氮/含氧化合物分析,、汽油添加劑分析,、脂肪烴分析、芳烴分析,；
·環(huán)境分析：大氣污染物分析,、水分析,、土壤分析、固體廢棄物分析,；
·食品分析：農藥殘留分析,、香精香料分析,、添加劑分析、脂肪酸甲酯分析,、食品包裝材料分析； ·藥物和臨床分析：雌三醇分析,、兒茶酚胺代謝產物分析,、尿中孕二醇和孕三醇分析、血漿中睪丸激素分析,、血液中乙醇/麻醉劑及氨基酸衍生物分析；
·農藥殘留物分析：有機氯農藥殘留分析,、有機磷農藥殘留分析,、殺蟲劑殘留分析、除草劑殘留分析等,；
·精細化工分析：添加劑分析、催化劑分析,、原材料分析、產品質量控制；
·聚合物分析：單體分析,、添加劑分析、共聚物組成分析,、聚合物結構表征/聚合物中的雜質分析,、熱穩(wěn)定性研究；
·合成工業(yè)：方法研究,、質量監(jiān)控,、過程分析；
1980年,，張宗炳指導研究生,，用紙層析及液相色譜(HPLC)方法鑒定出這種芳香胺類為酪胺；
20世紀80年代到21世紀初,，是色譜技術發(fā)展zui快的20年,，許多嶄新的色譜法方法開始出現(xiàn)，如在氣相色譜中的毛細管柱工藝的發(fā)展,，毛細管超臨界流體色譜和超臨界流體萃取的興起,，毛細管電泳的發(fā)展,，電名譜加入色譜的行列，場流分離為生物大分子的分離提供了新的途徑等等,。21世紀將是生命科學,，材料科學,，信息科學，和環(huán)境科學的時代,，而環(huán)境科學又是人們面臨的重大課題,，色譜法新方法的出現(xiàn)和發(fā)展正是服務于這些重要科室領域的新技術。為了生物大分子的分離和純化,，推動了毛細管電泳和全新的液相色譜的發(fā)展；為了解決藥物對映異構體的拆分,，發(fā)展了各種各樣的手性分離介質,；為了極數(shù)微量環(huán)境污染物的檢測,，發(fā)展了各種色譜高靈敏檢測器；為了適應石油化工的需要,，出現(xiàn)了各種高溫毛細管氣相色譜法方法,；為了能高選擇性地分離生化分子,，發(fā)展發(fā)選擇性*的親和色譜柱和方法為了有效快速地分離蛋白質和多肽發(fā)展了整體色譜柱。另一方面,，為了彌補色譜法定性功能較差的弱點，大力發(fā)展了色譜和其他儀器的聯(lián)用技術,，特別是液相色譜,、氣相色譜和毛細管電泳與質譜的聯(lián)用技術近年已趨于成熟，對生物大分子的分離和鑒定發(fā)揮極大的作用,，因此色譜儀和其他各種儀器的聯(lián)合使用將成為分析化學的重要領域。
3.2新中國色譜儀器行業(yè)的興起
1953年在新中國*個五年計劃中,，由盧佩章院士領導的研發(fā)小組設計出我國*臺體積色譜儀,，使分析石油樣品的速度由原來的30多個小時縮短到不到1小時,，而且所用樣品量僅是原來的千分之一；
1962年,，徐民宗等先后研制了101A型及P-150型氣相色譜儀,。P-150型氣相色譜儀由大化所儀器廠小批量生產供院內研究所使用；
1963年，朱葆琳,、丁景群 等研制成SP-01型氫火焰離子化鑒定毛細管色譜儀并推廣到北京科學儀器廠生產,；
1964年，汪驥,、鐘衡等成功研制的SP-02型氫火焰離子化鑒定器填充柱氣相色譜儀。在國內建立了*個色譜儀器生產廠---大連市第二儀表廠；
1965年,，研制了SP-04型高純*性氣體自動分析色譜儀,，用于分析純氮中的雜質氧,、氬,，或者純氬中的雜質氧,、氮，由南京分析儀器廠生產,；
1965年,，丁景群、陳大衛(wèi)等研制成用于制備高純化合物的PSZ-1型自動化制備色譜儀,。并在此基礎上,，在朱葆琳的指導下有進一步放大研制成大型工業(yè)自動化制備色譜裝置，1969年應用于天津試劑二廠試劑生產,；
1973年,，完成兩種不同要求的密閉船內大氣自動分析色譜儀，分別提供七機部五院及邯鄲109*,，供飛船及潛艇使用,；
1973年，由楊書明,、周良模等成功研制出實驗室通用的SP-08型多用氣相色譜儀,；
1981年，唐學淵,、鐘秀貞等在國內成功用微機進行自動控制與數(shù)據(jù)處理氦氣純度分析儀,。 中國的色譜事業(yè)在zui近三十年里得到了飛躍性的發(fā)展，國內的色譜儀器廠家風生水起,，面對國外品牌的競爭,，依然在國內分析市場上占有一席之地，并保持了良好的發(fā)展勢頭,，我們深信中國色譜儀器行業(yè)終將走出,，走向世界。
三,、新中國色譜技術走向世界國內色譜
技術蓬勃發(fā)展,，中國色譜專家同時也非常注重間色譜技術的交流。隨著間交流加深，中國的色譜技術已經跟上了世界的步伐：
1959年,，盧佩章院士應邀參加前蘇聯(lián)*次全蘇色譜會上作大會報告,，并在前蘇聯(lián)色譜創(chuàng)始人的著作和前民主德國的著作中被引用；
1960年,，民主德國色譜學會主席struppe博士發(fā)表在其所著的《氣相色譜的新進展》一書中共收錄了三篇過過學術文章,，其中包括盧佩章院士在全蘇色譜會議上的大會報告；改革開放后,，中國的色譜技術迅速發(fā)展,，中國的色譜技術再次走出走向世界，中國與德國開展可深入的交流,。1981年11月份中德*屆色譜會議在大連召開標志著中國正式與德國建立又好的學術交流關系，迄今為止中的色譜會議已經成功舉辦七屆,；
1980年PE公司到大連化物所研究考察,； 1982中國參加匹茲堡會議； 1981年中德色譜會議在大連召開,，
1985年首屆BECIA大會在北京召開,，上大多數(shù)的色譜學者參加了本次會議，促進了中國色譜技術與國外色譜技術的交流,，標志著中過色譜事業(yè)已經成功與世界色譜事業(yè)接軌,，中國有了自己的分析科學與儀器方面的會議；
近年來,，中國的色譜研究有了較大的發(fā)展,，取得了一些在上有影響的成果，在*學術期刊上發(fā)表了相當數(shù)量的論文,，為國家的經濟發(fā)展作出了貢獻,，這是應當充分肯定的。特別是色譜與生命科學的交叉研究,、色譜與其它分析技術的聯(lián)用表現(xiàn)得異?；钴S。
近年來,，利用固定化金屬螯合親和膜分離純化蛋白質的研究取得了很大進展,。美國公司曾報道用以木纖維為原料的復合纖維素離子交換機金屬螯合膜色譜分離純化人尿激酶;鮑時翔等人采用中空纖維膜成功的 從人血清中分離出免疫球蛋白。另據(jù)報道,，Iwata等在聚丙烯膜上接枝甲基丙烯酸縮水甘油酯,，制得銅離子親和膜用于吸附含有組氨酸-亮氨酸的多肽以及牛血清蛋白。Klaus等則以化學改性的聚砜作為膜材料,，制得金屬離子螯合親和膜,，用于組氨酸，苯丙氨酸，蘇氨酸和丙氨酸等小分子氨基酸混合物的分離等開展了用聚乙酰氨基葡萄糖親和膜分離溶菌酶的研究,。
隨著研究的深入,，科學家又提出通過遺傳學的重組技術，在待分離的蛋白質表面連接上對金屬離子有親和性的氨基酸殘基(如組氨酸,，半胱氨酸,，色氨酸等)，以促進蛋白質的分離和純化,，使固定化金屬螯合親和膜分離純化蛋白質的應用前景更加廣闊,。
4.結論
本文給出了親和色譜的原理過程及發(fā)展歷史，隨著親和色譜在生物化工,，化學方面的廣泛應用及廣闊的發(fā)展前景,，隨著研究的深入，必將成為各項科學發(fā)展各一項重要技術,，將會發(fā)揮越來越重要的作用,。
主要參考文獻
【1】 于世林。親和色譜方法及應用,。 北京：化學工業(yè)出版社,，2008
【2】 張津輝 蔣中華 馬立人。親和色譜進展,。北京：軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所,，1999 【3】 盧時湧 吳章桂。應用前沿親和色譜研究分子之間相互作用及其應用,。杭州,； 浙江工業(yè)大學 2010