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外源性DNA殘留量測定法
*法 DNA探針雜交法
供試品中的外源性DNA經(jīng)變性為單鏈后吸附于固相膜上，在一定溫度下可與相匹配的單鏈DNA復(fù)性而重新結(jié)合成為雙鏈DNA，稱為雜交,。將特異性單鏈DNA探針標(biāo)記后,，與吸附在固相膜上的供試品單鏈DNA雜交，并使用與標(biāo)記物相應(yīng)的顯示系統(tǒng)顯示雜交結(jié)果,，與已知含量的陽性DNA對照比對后,，可測定供試品中外源性DNA的含量。
試劑（1）DNA標(biāo)記和檢測試劑盒 （2）DNA雜交膜尼龍膜或硝酸纖維素膜,。
（3）2%蛋白酶K溶液 稱取蛋白酶K 0.20g,，溶于滅菌水10ml中，分裝后儲藏于-20℃?zhèn)溆谩?nbsp;
（4）3%牛血清白蛋白溶液 稱取牛血清白蛋白0.30g,，溶于滅菌水10ml中,。 （5）1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0） 用鹽酸調(diào)pH值至8.0。 （6）5.0mol/L氯化鈉溶液
（7）0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0） 用10mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0,。
（8）20%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液 用鹽酸調(diào)pH至7.2,。
（9）蛋白酶緩沖液（pH8.0） 量取1mol/L Tris溶液1.0ml（pH8.0），5mol/L 氯化鈉溶液2.0ml,，0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液(pH8.0）2.0ml,，20%SDS溶液 2.5 ml， 加滅菌水至10ml,。
（10）TE緩沖液（pH8.0） 量取1mol/L Tris溶液（pH8.0）10ml,，0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）2ml，加滅菌水至1000ml,。
（11）1%魚精DNA溶液 精密稱取魚精DNA 0.10g,，置10ml量瓶中，用TE緩沖液溶解并稀釋至刻度,， 搖勻,，用7號針頭反復(fù)抽打以剪切DNA成為小分子，分裝后貯藏于-20℃?zhèn)溆谩?nbsp;
（12）DNA稀釋液 取1%魚精DNA溶液50μl，加TE緩沖液至10ml,。
用于探針標(biāo)記和陽性對照的DNA制備 用于探針標(biāo)記和陽性對照的DNA,，由生產(chǎn)供試品用的傳代細胞、工程菌或雜交瘤細胞提取純化獲得,，其提純和鑒定可參考下述推薦方案進行,，具體方法可參考《分子克隆實驗指南》（［美］J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯,，科學(xué)出版社,，2002）或《精編分子生物學(xué)實驗指南》（［美］F.奧斯伯等著，顏子穎,、王海林譯,，科學(xué)出版社，1998）,。
將待提取的細胞基質(zhì)懸液的細胞濃度調(diào)整為每1ml含107個細胞,，如果為細菌，則將其濃度調(diào)整為每1ml含108個細胞細菌,。取懸液1ml,，離心，在沉淀中加裂解液400μl混勻,，37℃作用12～24小時后,，加入飽和酚溶液450μl，劇烈混合,，以每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘,，轉(zhuǎn)移上層液體，以飽和酚溶液450μl重復(fù)抽提一次,；轉(zhuǎn)移上層液體,，加入三氯jia烷450μl，劇烈混勻,，以每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘,；轉(zhuǎn)移上層液體，加入pH 5.2的3mol/L醋酸鈉溶液40μl,，充分混合,，再加入-20℃以下的無水乙醇1ml，充分混合,，-20℃以下作用2小時,，以每分鐘15000轉(zhuǎn)離心15分鐘；用適量-20℃70％乙醇溶液洗滌沉淀1次,，以每分鐘15000轉(zhuǎn)離心15分鐘,，棄上清液，保留沉淀，吹至干燥后,，加適量滅菌TE緩沖液溶解,，RNase酶切,，酚/三氯jia烷抽提,，分子篩純化DNA，即得,。
用1%瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度法鑒定陽性對照品的DNA純度：應(yīng)無RNA和寡核苷酸存在,；A260/A280比值應(yīng)在1.8～2.0之間（測定時將供試品稀釋至A260為0.2～1.0）。
用于陽性對照和標(biāo)記探針的DNA在使用前應(yīng)進行酶切或超聲波處理,，使其片斷大小適合于DNA雜交和探針標(biāo)記,。
陽性對照品的DNA濃度根據(jù)下式計算
DNA濃度（ng/μl）= 50×A260
陽性對照品可分裝于適宜的小管中，-20℃以下保存,，長期使用,。 探針的標(biāo)記 按試劑盒使用說明書進行。
測定法 （1）蛋白酶 K預(yù)處理 按下表對供試品,、陽性和陰性對照進行加樣,，混合后37℃保溫4小時以上，以保證酶切反應(yīng)*,。
注意事項：供試品的稀釋
根據(jù)成品zui大使用劑量,，用DNA稀釋液將供試品（原液）稀釋至每100μl 含1人份劑量；如成品zui大使用劑量較大,，而供試品的蛋白含量較低,，可用DNA稀釋液將供試品稀釋至每100μl 含1/10人份劑量或每100μl含1/100人份劑量。
D1,、D2,、D3為稀釋的陽性DNA對照。用DNA稀釋液稀釋至每1ml中含DNA 1000ng,。然后依次10倍稀釋成10ng/100μl (D1),、1ng/100μl (D2)、100pg/100μl (D3)三個稀釋度,；如成品使用劑量較大,，而且DNA*（100pg/劑量）較嚴(yán)格時，則需要提高DNA檢測靈敏度,，相應(yīng)的陽性DNA對照應(yīng)稀釋成100pg /100μl (D1),、10pg /100μl (D2)、1pg/100μl (D3)三個稀釋度,。陰性對照為DNA稀釋液,，空白對照為未進行蛋白酶 K預(yù)處理的TE緩沖液。
當(dāng)供試品1/100人份劑量大于100μl時，終體積也隨之增大,，一般終體積為供試品體積的一倍左右,，供試品體積和終體積相差過小，可能會影響蛋白酶 K的活性,。
2％蛋白酶 K溶液和蛋白酶緩沖液的比例為1/20,，蛋白酶緩沖液和終體積的比例為1/10。
加入3％牛血清白蛋白溶液適量,，是為了使陽性對照和陰性對照中含有一定的蛋白質(zhì)與供試品（通常為蛋白質(zhì)）的酶切條件保持一致,；如供試品為其他物質(zhì)，則應(yīng)改用其他相應(yīng)物質(zhì),。
若預(yù)處理后的供試品溶液中的蛋白質(zhì)干擾本試驗,，可用上述飽和酚溶液抽提法或其他適宜方法提取供試品DNA（陽性對照、陰性對照也應(yīng)再次提取DNA,，與供試品溶液平行）,。 （2）點膜 用TE緩沖液浸潤雜交膜后，將預(yù)處理的供試品,、陽性對照,、陰性對照與空白對照置100℃水浴加熱10分鐘，迅速冰浴冷卻,，以每分鐘8000轉(zhuǎn)離心5秒,。用抽濾加樣器點樣于雜交膜(因有蛋白質(zhì)沉淀，故要視沉淀多少確定加樣量,，以避免加入蛋白質(zhì)沉淀,。所有供試品與陽性對照、陰性對照,、空白對照加樣體積應(yīng)一致,，或按同樣比例加樣)。晾干后置80℃真空干烤1小時以上,。
（3）雜交及顯色 按試劑盒使用說明書進行,。
結(jié)果判定 陽性對照應(yīng)顯色，其顏色深度與DNA含量相對應(yīng),，呈一定的顏色梯度,；陰性、空白對照應(yīng)不顯色,，或顯色深度小于陽性DNA對照D3,，試驗成立。將供試品與陽性對照進行比較,，根據(jù)顯色的深淺判定供試品中外源性DNA的含量,。
第二法 熒光染色法（新增）
PicoGreen是一種高靈敏度雙鏈DNA熒光染料,。該染料與雙鏈DNA特異結(jié)合形成復(fù)合物，在波長480 nm激發(fā)下產(chǎn)生*熒光信號,，可用熒光酶標(biāo)儀在波長520 nm處進行檢測,，在一定的DNA濃度范圍內(nèi)以及在該熒光染料過量的情況下，熒光強度與DNA濃度成正比,，根據(jù)供試品的熒光強度,，計算供試品中的DNA殘留量。
試劑 （1）20×TE緩沖液（200 mM Tris-HCl,，20 mM EDTA,，pH7.5） 加滅菌水配置成1×TE,。
（2） PicoGreen染料 用1×TE緩沖液將PicoGreen染料稀釋200倍,，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，并注意避光,。
（3） DNA標(biāo)準(zhǔn)品 取DNA標(biāo)準(zhǔn)品適量溶于TE中,，制成100 μg/ml DNA標(biāo)準(zhǔn)品，于-20℃條件下保存,。
標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 用1×TE緩沖液將DNA標(biāo)準(zhǔn)品配成0ng/ml,、1.25ng/ml、2.5ng/ml,、5.0ng/ml,、10ng/ml、20ng/ml,、40ng/ml,、80 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
測定法 精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液各400錯誤,！未找到引用源,。l于1.5ml 離心管中，分別加入稀釋后的PicoGreen染料400 錯誤,！未找到引用源,。l，混勻后,，避光室溫放置5 分鐘,。取250錯誤！未找到引用源,。l上述反應(yīng)液于96孔板黑色酶標(biāo)板中,，并做3個復(fù)孔。用熒光酶標(biāo)儀于激發(fā)波長480nm,、發(fā)射波長520nm處測定熒光強度,。以1×TE緩沖液測得的熒光強度為本底,，測定和記錄各測定孔的熒光值。 用標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度（ng/ml）對其相應(yīng)的熒光強度作直線回歸（相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于,？）,，將供試品溶液的熒光強度代入回歸方程，求出供試品的殘余DNA含量（ng/ml）,。
注意事項 （1）該法DNA檢出限為0.3 ng/ml,。DNA含量在1.25-80 ng/mL范圍線性較好，因此供試品DNA含量在該范圍內(nèi)可定量測定,；當(dāng)DNA含量低于1.25 ng/mL時應(yīng)為*,，表示為小于1.25 ng/mL。
（2）若供試品對回收率和精密度無干擾,，則可直接測定,。
（3）若精密度好，但供試品輕微干擾回收率時,，無需對供試品DNA做進一步純化,，可直接測定，但每次測定均應(yīng)增加回收率實驗,，并用回收率對測定結(jié)果進行校正,。
（4）若供試品嚴(yán)重干擾回收率和精密度時，應(yīng)采用適宜方法（參見本項目*法）純化DNA以排除干擾,，直至精密度和回收率試驗均符合要求,。需要純化DNA后再進行測定的供試品，每次測定均應(yīng)從純化步驟起增加回收率實驗,，并用回收率對測定結(jié)果進行校正,。