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蛋白質(zhì)/多肽液相分析中的流動相選擇

有機(jī)溶劑可將吸附在疏水界面的蛋白質(zhì)洗脫（圖14）,。

在梯度洗脫期間,，當(dāng)有機(jī)溶劑量達(dá)到針對每一蛋白質(zhì)的特定濃度時，蛋白質(zhì)就會從疏水界面上解吸,，繼續(xù)順著柱向下,，從而從柱中洗脫。

圖14. 當(dāng)有機(jī)改性劑的濃度達(dá)到特定值時,，蛋白質(zhì)從疏水界面洗脫,。


乙腈。在多肽的反相色譜分離時常用的有機(jī)溶劑為乙腈,。為什么選擇乙腈,？

• 乙腈易揮發(fā)，易從樣品中去除,。

• 乙腈黏度低,，柱壓低,。

• 乙腈的紫外吸收截止波長較短。

• 乙腈長期用于分離應(yīng)用,。

異丙醇,。異丙醇在多肽的色譜分離中具有重要作用。盡管異丙醇黏度大（會增大柱壓）,，很少單獨用作有機(jī)改性劑,，但其在提高一些多肽的回收率方面具有重要作用，尤其是強(qiáng)疏水性蛋白,。
在此類情況下,，以1%~5%的恒定濃度加入異丙醇，以提高疏水性多肽的回收率或洗脫,。
 

其它有機(jī)改性劑,。很少使用甲醇或乙醇等有機(jī)改性劑，除非在分離強(qiáng)疏水性蛋白時,。此外,，由于乙醇毒性低，因此還用于蛋白質(zhì)的大規(guī)模純化,。

梯度洗脫,。多肽的洗脫幾乎都采用梯度洗脫法，采用梯度洗脫法分離時,，逐漸增大有機(jī)溶劑的相對濃度,。
當(dāng)有機(jī)改性劑的濃度升到解吸所需的特定濃度時，蛋白質(zhì)和多肽就從柱上洗脫,。如圖15所示,，有機(jī)改性劑的濃度（梯度）變化速率越慢，這些蛋白亞基的分辨率越高,。
在該例中,，相較于每分鐘0.5%的梯度變化速率，每分鐘0.25%的梯度變化顯著提高了分辨率,。
蛋白質(zhì)/多肽的保留機(jī)制的圖1中顯示了采用每分鐘0.15%的梯度變化速率時幾種胰島素的分離過程,。采用每分鐘0.05%的梯度變化速率洗脫時，分辨率大,。
 

圖15. 一般情況下,，降低有機(jī)溶劑濃度變化速率會提高分辨率。

A.   細(xì)胞色素c亞基

B.   色譜圖A中間片段的重現(xiàn),。

色譜柱：C4 寬孔柱,， 4.6 x 250 毫米

降低梯度變化速率增加分辨率時，所需的分析時間必須盡可能短,。
但是,，梯度變化速率的調(diào)整在優(yōu)化蛋白質(zhì)和多肽的分辨率方面非常重要,。
 

有時，降低梯度變化速率時,，多肽會表現(xiàn)出特異行為（圖16）,。
分辨率有時不會按照預(yù)期增加，反而會降低,，導(dǎo)致出現(xiàn)共洗脫,，甚至洗脫順序也會顛倒。
在圖16的示例中,，洗脫時間為45分鐘時多肽11和12表現(xiàn)出蕞佳的分離效果,。
當(dāng)洗脫時間增加至90分鐘時，多肽11和12間的分辨率降低,；而當(dāng)洗脫時間增加至160分鐘時,，出現(xiàn)共洗脫峰。
這種保留行為是多肽表面相互作用的結(jié)果,，導(dǎo)致這種行為的原因目前尚不清楚,。
因此，在進(jìn)行多肽分離時,，尤其是在分離蛋白酶水解物時,，觀察分辨率隨梯度坡度降低的變化很重要。
如果分辨率未增加,，反而降低，則必須優(yōu)化梯度變化速率,，以大化整體分辨率,。
 

圖16. 多肽間分辨率有時隨著溶劑濃度變化速率的降低（洗脫時間增加）而降低。
這將導(dǎo)致分辨率降低或共洗脫峰的出現(xiàn),，如人生長激素肽圖中多肽11和12例示,。
在一些情況下，多肽甚至?xí)孓D(zhuǎn)洗脫順序,。

樣品人生長激素的胰蛋白酶水解物,。部分顯示了多肽圖譜。

色譜柱：C18寬孔柱,，4.6 x 150 mm

洗脫液：梯度：0~60%乙腈與水溶性溶劑和0.1%TFA混合液和有機(jī)溶劑與0.08%TFA混合液在一定時間內(nèi)形成梯度洗脫,。

蛋白質(zhì)和多肽的反相色譜分析法需要“離子對試劑”。
在流動相中加入離子對試劑,，以實現(xiàn)良好的峰形,。
目前認(rèn)為，在沒有離子對試劑的情況下,，硅膠表面的金屬雜質(zhì)是導(dǎo)致蛋白質(zhì)/多肽峰形較差的原因,。

三氟yi酸,。三氟yi酸（TFA）是常用的離子對試劑。將濃度為~0.1%的三氟yi酸加入流動相,，會在大多數(shù)柱上產(chǎn)生良好的峰形（圖17）,。
降低TFA的濃度能提高LC-MS的檢測靈敏度（見22~25頁），但由于硅膠表面存在雜質(zhì),，可能會導(dǎo)致硅膠柱上的峰形較差,。
但采用高純度硅膠柱時，可加入低濃度TFA（圖17A——0.01% TFA）,。

圖17. TFA濃度對峰形和選擇性的影響

洗脫液：加入如圖所示的TFA,，以20%~32%的乙腈（ACN）梯度洗脫，洗脫時間為15分鐘,。
樣品1.血管緊張素II 2.血管緊張素III3.血管緊張素I

其它離子對試劑,。盡管目前為止TFA仍是常用的離子對試劑，但蛋白質(zhì)/多肽分離有時會采用磷酸和七氟丁酸（HFBA）等其它試劑,。

如圖18所示,，一些情況下，磷酸可分離一些TFA無法分離的多肽,。通常磷酸鹽使用濃度約為20-30 mM,，pH為2~2.5。此外,，磷酸鹽緩沖液對一些蛋白質(zhì)的分離效果要優(yōu)于TFA,。
盡管同TFA一樣，磷酸鹽緩沖液使用的pH通常較低,，但磷酸鹽緩沖液也能適應(yīng)較高的pH,，為選擇性和分辨率的改變提供了機(jī)會（見17頁）。
將磷酸鹽作為離子對試劑的主要弊端是：磷酸鹽不揮發(fā),，很難從肽中去除,。

一些時候，七氟丁酸用作組蛋白等堿性蛋白分離的離子對試劑

圖18. 使用除TFA以外的離子對試劑可能會產(chǎn)生不同的選擇性

條件
色譜柱：C18 寬孔柱,， 4.6 x 250 毫米

洗脫液：
A.4%~40% 乙腈—0.1%TFA體系,，pH=2,18分鐘梯度洗脫。
B.4%~40% 乙腈—20mM 磷酸體系,，pH=2,18分鐘梯度洗脫,。
樣品:

1. 緩激肽

2. 神經(jīng)降壓素

3. 蛙皮素

4. 章魚唾腺精

pH值對多肽保留行為的影響。不論采用TFA和磷酸,，還是其它離子對試劑,，用于多肽分離的反相流動相通常適應(yīng)的pH值較低。
在低pH值條件下，羧酸基團(tuán)——端羧基,，以及天冬氨酸和谷氨酸的側(cè)鏈會進(jìn)行質(zhì)子化,，且僅有輕微極性。
將流動相的pH值增加至6~7將會使羧酸基團(tuán)離子化,，減弱多肽的疏水性,。這將降低各種多肽的保留值，但尤其影響含天冬氨酸或谷氨酸的多肽（圖19）,。
與其它多肽相比,，含天冬氨酸和谷氨酸的多肽的保留值降低更多，從而改變了選擇性,。盡管增加多肽分離流動相pH的做法不經(jīng)常采用,，但它可以在一些特定情況下發(fā)揮作用。

圖19. 流動相的pH值會影響多肽的保留值,，尤其是含酸性氨基酸殘基（天冬氨酸和谷氨酸）的多肽,。

條件
色譜柱：ACE 5 C18-300，4.6 x 250 mm
洗脫液：
A.20%~32% 乙腈—0.1%TFA體系,，pH=2,15分鐘梯度洗脫,。
B.20%~32% 乙腈—10mM NH4OAc體系，pH=7,15分鐘梯度洗脫,。
樣品

1. 血管緊張素II

2. 血管緊張素III

3. 血管緊張素I
   
    

流速,。流動相的流速對反相液相色譜法分離的分辨率影響不大。
如圖20所示,，流動相流速為0.5,、1.0或2.0 ml/min時，胰蛋白酶圖譜中多肽的分辨率大致相同,。
但梯度體積必須恒定才能維持分辨率一致,。
這需要隨著流速的增加減少梯度洗脫時間。
體系壓力隨著流速的增加而增加,；體系壓力可能會限制可用的流速。
此外,，較高的流速還會使檢測靈敏度稍有降低,，但可能增加大分子蛋白或疏水性蛋白的溶解度。

圖20. 流動相的流速對多肽的分辨率影響不大,。隨著流速的變化,，總梯度體積必須保持恒定才能維持分辨率一致。

條件
色譜柱：C18小孔柱,，4.6 x 250 mm
洗脫液：10%~50% 乙腈~0.1% TFA 體系,，時間、流速如圖所示
樣品β-乳球蛋白的胰蛋白酶水解物