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引言
反相HPLC已成為分離和分析蛋白質(zhì)和多肽的重要工具。
它在生物技術(shù)行業(yè)中被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)類(lèi)治療產(chǎn)品的表征,，以及這些產(chǎn)品和雜質(zhì)的鑒定,。
在通過(guò)質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)之前，反相HPLC在從消化后的蛋白質(zhì)組中分離多肽方面有著至關(guān)重要的作用,。
它也被用于探索性研究中多種蛋白質(zhì)和多肽的純化,，以及蛋白類(lèi)治療藥物的大規(guī)模純化。
反相HPLC靈敏,、通用性強(qiáng),，還可與質(zhì)譜等技術(shù)結(jié)合使用，在蛋白質(zhì)研究中具有重要的地位,。
此外,，它還能夠分離結(jié)構(gòu)近乎相同的蛋白質(zhì)，因而得到了廣泛的應(yīng)用,。
正如牛,、人和豬胰島素變異體的分離過(guò)程所示（圖1），反相HPLC能夠分離非常相似的蛋白質(zhì),。
牛胰島素和人胰島素僅有三個(gè)氨基酸的差別,，也能夠被*分離開(kāi)來(lái)。
牛胰島素在胰島素“a”鏈的第8位為丙氨酸,，第10位為纈氨酸,，“b”鏈的第30位為丙氨酸。
而人胰島素在胰島素“a”鏈的第8位為蘇氨酸,，第10位為異亮氨酸,，“b”鏈的第30位為蘇氨酸。
圖1. 以RP-HPLC對(duì)緊密關(guān)聯(lián)的胰島素變異體進(jìn)行分離
條件 色譜柱：ACE 5 C18,4.6 x 250mm 洗脫液：含有29.3 - 31.7% 乙腈的 0.1% 三氟yi酸溶液，以1.0毫升/分鐘的速率洗脫至少16分鐘 樣品：牛,、人和豬胰島素 |  |
豬胰島素和人胰島素僅有一個(gè)氨基酸的差異（豬胰島素的“b”鏈第30位為丙氨酸,，人胰島素該位置為蘇氨酸），在基線即已分離,。
在另一個(gè)實(shí)例中,，盡管兔胰島素和人胰島素僅有一個(gè)氨基酸的差異，即以蘇氨酸取代了絲氨酸,，但也同樣得到了分離（參考文獻(xiàn)1）,。
反相HPLC的高分離能力也被擴(kuò)展應(yīng)用到了多肽上。
在圖2中,，兩種多肽盡管只有一個(gè)氨基酸的差異,，即絲氨酸對(duì)蘇氨酸，但也得到了*的分離,。
這種高分離能力是反相HPLC在蛋白質(zhì)和多肽分離中得到廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)性因素,。
圖2. 以RP-HPLC對(duì)緊密關(guān)聯(lián)的多肽進(jìn)行分離。僅有一個(gè)氨基酸不同的兩種十肽菌素,，一種含絲氨酸,，而另一種含蘇氨酸。
條件
色譜柱：C18 寬孔柱,， 4.6 x 250 毫米
洗脫液：
A. 含有0.1%三氟yi酸的水溶液
B. 含有0.08%三氟yi酸的乙腈溶液
梯度：0 - 35%的B溶液超過(guò)73分鐘（參考文獻(xiàn)2） |  |
蛋白質(zhì)/多肽的保留機(jī)制
在反相HPLC中,，顆粒表面是十分疏水的，因?yàn)槠浔砻嫱ㄟ^(guò)化學(xué)連接有羥基（圖3中的波浪形紅線）,。
通過(guò)疏水表面對(duì)蛋白質(zhì)一面（被稱為“疏水性足”）的吸附,，蛋白質(zhì)被保留下來(lái)（圖3）。
與疏水表面的厚度相比,，蛋白質(zhì)要大得多,，因此蛋白質(zhì)僅有一部分被疏水表面所吸附。
大部分蛋白質(zhì)位于表面上方并與流動(dòng)相接觸,。
由這種疏水性吸附所導(dǎo)致的凈相互作用非常強(qiáng),，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)保持吸附在表面上（圖4A），直至接觸到特定濃度的有機(jī)溶劑,，這時(shí)蛋白質(zhì)會(huì)從表面上解吸附并從色譜柱上洗脫（圖4B）,。
在初的吸附/解吸附之后，盡管蛋白質(zhì)在從色譜柱上移動(dòng)下來(lái)時(shí)仍會(huì)與表面產(chǎn)生一些相互作用,，但卻是十分微弱的，對(duì)分離過(guò)程無(wú)影響,。
分離是由單次吸附/解吸附過(guò)程完成的,。
解吸蛋白質(zhì)所需要的有機(jī)改性劑的濃度十分，并與疏水足的大小呈函數(shù)關(guān)系。
詳情請(qǐng)參閱參考文獻(xiàn)3,。
圖4. 進(jìn)入色譜柱的蛋白質(zhì)被吸附在柱頂端附近的疏水表面上（A）并且一直保持吸附,，直至有機(jī)改性劑的濃度達(dá)到特定值，此時(shí)蛋白質(zhì)從表面解吸附（B）,。
在反相HPLC中,，吸附/解吸保留機(jī)制導(dǎo)致蛋白質(zhì)的保留行為與小分子不同。
小分子的保留行為隨著有機(jī)溶劑濃度的改變而緩慢改變時(shí)（圖5,，聯(lián)苯）,，一旦有機(jī)溶劑的濃度達(dá)到所需要的值，蛋白質(zhì)的保留行為即發(fā)生突然改變,，引起保留時(shí)間的快速變化（圖5,，蛋白質(zhì)）。
該過(guò)程產(chǎn)生的尖銳峰形常見(jiàn)于蛋白質(zhì)和多肽（圖6A）,。
由于有機(jī)溶劑濃度的微小變化會(huì)引起的顯著的保留行為變化,，等度洗脫很少被用于蛋白質(zhì)中，因?yàn)榉遄儗捔?，而有機(jī)溶劑的微小改變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)保留行為的巨大變化（圖6B）,。
圖5.有機(jī)溶劑濃度對(duì)應(yīng)的保留行為
圖6.
A. 梯度洗脫過(guò)程中多肽和蛋白質(zhì)洗脫出尖銳峰形。
B. 等度洗脫下,，蛋白質(zhì)的峰形（本例中為溶菌酶）很寬,，有機(jī)溶劑的微小改變都會(huì)引起保留時(shí)間的巨大變化。
