關鍵詞:酶聯免疫(ELISA)|實驗技術服務
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酶聯免疫(ELISA)|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序實驗流程：
基本原理
①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面,，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體,，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性,，又保留酶的活性。在測定時,，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應,。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，zui后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例,。加入酶反應的底物后,，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析,。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果,，從而使測定方法達到很高的敏感度,。
ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。
在這種測定方法中有3種必要的試劑：
①固相的抗原或抗體
②酶標記的抗原或抗體
③酶作用的底物,。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件,，可設計出各種不同類型的檢測方法。
注意事項
⒈ 正式試驗時,，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性,。有時本底較高,，說明有非特異性反應，可采用羊血清,、兔血清或BSA等封閉,。
⒉ 在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的,，其中包括：
⑴ 固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體,，如聚氯乙烯、聚苯乙烯,、聚丙酰胺和纖維素等,。其形式可以是凹孔平板、試管,、珠粒等,。當前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被,，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性,，據此判明其吸附性能是否良好,。
⑵ 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好,，吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度,，時間及其蛋白量也有一定影響,，一般多采用4℃18～24小時。蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度（0.1,、1.0和10μg/ml等）進行包被后,，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值,。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度,。對于多數蛋白質來說通常為1～10μg/ml。
⑶ 酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法"（包被物,、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統里準確地滴定其工作濃度,。
⑷ 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全,、有明顯地顯色反應,，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用,，應注意防護,。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體,，如TMB和ABTS是當前較為滿意的供氫體,。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿以終止反應,。通常底物作用時間,，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,，尤其是H2O2在臨用前加入,。
檢測步驟
ELISA用血清來檢測，首先血液要經過至少半個小時的凝集,，然后取血清,。將酶復合物用稀釋液稀釋后，加血清及陰性,、陽性對照,，還有就是質控品（這是嚴格的要求，它的范圍必須在質控范圍內）,。經過一個小時的孵育,，然后洗板，加底物,，半個小時避光反應后加終止液即完成反應部分,，然后就是讀數。由數值來判斷結果的陰性或陽性,。
雙抗體夾心法
一,、將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質,。
二,、加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合,，形成固相抗原復合物,。洗滌除去其他未結合的物質,。
三、加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合,。*洗滌未結合的酶標抗體,。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
四,、加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物,。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。