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關鍵詞:基因克隆與定點突變服務|實驗技術服務
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基因克隆與定點突變服務|實驗技術服務——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系,。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>定點突變是指通過聚合酶鏈式反應(PCR)等方法向目的DNA段(可以是基因組,也可以是質(zhì)粒)中引入所需變化(通常是表征有利方向的變化),,包括堿基的添加,、刪除、點突變等。定點突變能迅速,、的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征,,是基因研究工作中一種非常有用的手段。
定點突變的比較有特色的產(chǎn)品還有Clontech公司的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit,,需要根據(jù)準備突變的質(zhì)粒自行設計兩條引物(同一方向,,對同一單鏈模版),一條包含計劃定點突變的序列,,另一條引物包含質(zhì)粒上某一個單酶切位點,,不過在單酶切位點中引入突變,這樣兩條引物除了所包含的突變位點,,其他序列和質(zhì)粒上對應位置的序列*一致,,退火后和質(zhì)粒模版結合,通過T4 DNA聚合酶延伸,,延伸反應持續(xù)直到碰到另一條引物停止,,兩段包含突變位點的延伸產(chǎn)物經(jīng)T4連接成環(huán),和模版鏈組成雜和環(huán),,帶有兩處錯配,。單酶切反應產(chǎn)物,直接轉化Ecoli BMH 71-18 mutS(錯配修復缺陷株),。原來的雙鏈質(zhì)粒模版被切開而不能轉化,,而雜和質(zhì)粒由于一條鏈上單酶切位點引入突變而不被切開,,保持環(huán)狀質(zhì)粒得以轉化,。轉化子的雜和雙鏈在E.coli的復制過程中分開,再經(jīng)過一輪提質(zhì)粒,、單酶切,、轉化,zui后得到純和的突變質(zhì)粒,。這個試劑盒則是利用改造單酶切位點使得新合成的突變質(zhì)粒不被切開從而除去原來的模版質(zhì)粒,。
有的時候研究可能需要多個位點的定點突變,比如改造酶的活性或者動力學特性,,研究蛋白之間的相互作用位點等,,單點突變不能滿足實驗的需要,重復進行單點突變也非常浪費時間,。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit,。zui多一次實驗可以引入5個定點突變。這個試劑盒的原理和Clontech的相似,,就是準備多個帶突變的引物(同方向,,對同一單鏈模版),退火后全部突變引物(不超過5個)都結合在同一環(huán)狀單鏈模版,PfuTurbo聚合酶延伸,,碰到下一個引物就停止,,各片斷經(jīng)連接成環(huán),和單鏈模版組成雜和環(huán),,DpnI消化雙鏈模版,,也消化雜和環(huán)中的模版,只留下新合成的帶多個突變的單鏈環(huán)(mutant ssDNA),,得以轉化E.coli,,形成雙鏈質(zhì)粒。資料表明,,引入3個定點突變的效率為60%,,5個定點突變的效率為30%。得到的其他質(zhì)粒是帶有較少定點突變的質(zhì)粒,,以引入3個定點突變?yōu)槔?,就是?0% 左右的轉化質(zhì)粒是帶有1-2個不同定點突變的質(zhì)粒(因為存在1-2個引物結合模版延伸形成單鏈環(huán)的可能)。
流程
定點突變一般須有含有待突變基因的高純度質(zhì)粒,,不少于10μg,,電泳圖清晰,達酶切及測序要求;
1.對待突變基因測序結果進行分析,,設計突變方案;
2.根據(jù)突變方案設計合成覆蓋突變位點的雙向引物,,合成目的DNA兩端引物,進行高保真PCR反應;
3.默認情況下,,將PCR產(chǎn)物克隆至T載,,或者根據(jù)要求亞克隆至目的載體;DNA測序驗證突變序列的正確性。
定點突變適用于蛋白結構已有初步了解的基因,,比PCR隨機突變更有目的性,,也更為,簡單,,同時改造基因更加"隨心所欲",。由于定點突變技術在蛋白質(zhì)組學中有這非常廣泛的應用前景,相信這個技術在不遠的將來還會有更大的改進和發(fā)展,,也必將為更多人熟悉應用,。
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