關(guān)鍵詞:多肽合成|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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多肽合成|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
多肽是一種與生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能都相關(guān)的生物活性物質(zhì),，它的分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間,，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過(guò)肽鍵結(jié)合而成的化合物,。多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)的總稱，常常被應(yīng)用于功能分析,、抗體研究,、尤其是藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
具體合成由下列幾個(gè)循環(huán)組成：
1） 去保護(hù)：Fmoc保護(hù)的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（piperidine）去 除氨基的保護(hù)基團(tuán),。
2） 激活和交聯(lián)：下一個(gè)氨基酸的羧基被一種活化劑所活化,?；罨膯误w與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián),，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成,。循環(huán)：這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成,。
3） 洗脫和脫保護(hù)：多肽從柱上洗脫下來(lái)，其保護(hù)基團(tuán)被一種脫保護(hù)劑（TFA） 洗脫和脫保護(hù),。
試劑檢測(cè)：沒(méi)有選購(gòu)在線檢測(cè)附件的多肽合成儀用戶,，也可以采用試劑檢測(cè)方法做基本的耦合效果測(cè)定實(shí)驗(yàn)。
固相多肽合成中,，主要是通過(guò)檢測(cè)樹(shù)脂上游離氨基來(lái)判斷連接效率,，檢測(cè)方法稱為Kaiser方法，其檢測(cè)結(jié)果，如果有游離氨基的時(shí)候,，顯示蘭色,，或紅褐色（pro，ser,，His）,。
Kaiser試劑包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液,；B,，80% 苯酚的乙醇溶液；C,，2% 0.001M KCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要經(jīng)過(guò)茚三酮處理后,，重蒸后再使用。檢測(cè)過(guò)程,，取少量樹(shù)脂,，加入A，B,，C各2-3滴,，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色,，或樹(shù)脂出現(xiàn)蘭色,，紅褐色，表明還有游離氨基,，否則說(shuō)明連接*,。
其它檢測(cè)游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法,，溴芬蘭法等.
氨基酸保護(hù)基 
20種常見(jiàn)氨基酸,，根據(jù)側(cè)鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸（Ala，Gly,，Val,，Leu，Ile,，）,，芳香族氨基酸（Phe，Tyr,，Trp,，His），酰胺或羧基側(cè)鏈氨基酸（Asp,，Glu,，Asn,，Gln），堿性側(cè)鏈氨基酸（Lys,，Arg）,，含硫氨基酸（Cys，Met）,，含醇氨基酸（Ser,，Thr），亞氨型基酸（Pro）,。多肽化學(xué)合成中氨基酸的保護(hù)非常關(guān)鍵,，直接決定了合成能夠成功的關(guān)鍵。因?yàn)槌Ｒ?jiàn)的20中氨基酸中有很多都是帶有活性側(cè)鏈的,，需要進(jìn)行保護(hù),，一般要求，這些保護(hù)基在合成過(guò)程中穩(wěn)定,，無(wú)副反應(yīng),，合成結(jié)束后可以*定量的脫除。合成中需要進(jìn)行保護(hù)的氨基酸包括：Cys,，Asp,，Glu，His,，Lys,，Asn，Gln,，Arg,，Ser，Thr,，Trp,，Tyr。需要進(jìn)行保護(hù)的基團(tuán)：羥基,，羧基,，巰基，氨基,，酰胺基,，胍基,，吲哚,，咪唑等。其中Trp也可以不保護(hù),，因?yàn)檫胚嵝再|(zhì)比較穩(wěn)定,。當(dāng)然在特殊的情況下,，有些氨基酸也可以不保護(hù)，象,，Asn,，Gln ，Thr,，Tyr,。
多肽縮合試劑 
目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法來(lái)完成接肽反應(yīng),，zui早使用的是將氨基酸活化為酰氯,，疊氮，對(duì)稱酸酐以及混合酸酐的方法,，但是由于這些條件下,，存在氨基酸消旋，以及反應(yīng)試劑危險(xiǎn)以及制備比較復(fù)雜,，逐漸被后來(lái)的縮合試劑取代,，按照其結(jié)構(gòu)可以分為兩種：縮合試劑主要有：碳二亞胺型，鎓鹽型（Uronium）,。 
液相多肽合成（solution phase synthesis） 
液相多肽合成現(xiàn)在仍然廣泛的使用,，在合成短肽和多肽片段上具有合成規(guī)模大，合成成本低的顯著優(yōu)點(diǎn),，而且由于是在均相中進(jìn)行反應(yīng),，可以選擇的反應(yīng)條件更加豐富，象一些催化氫化,，堿性水解等條件,，都可以使用，這在固相中,，使用卻由于反應(yīng)效率低,，以及副反應(yīng)等原因，無(wú)法應(yīng)用,。液相多肽合成中主要采用BOC和Z兩種反應(yīng)策略,。 
合成多肽分析鑒定方法 
多肽的分析鑒定方法有多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定,，多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)包括：質(zhì)譜分析,，氨基酸組成分析，氨基酸序列分析,。二級(jí)結(jié)構(gòu)包括：圓二色譜（CD）,，NMR，X-衍射等方法,。 
純度分析 
多肽的純度分析,，一般都采用HPLC進(jìn)行分析,，選擇RP-C18，粒徑5μm,，孔徑300A,，4.6×150mm，流動(dòng)相：A,，0.1% TFA/H2O,；B，0.1% TFA/ACN,，洗脫梯度,，5%B--65%B，時(shí)間30min,。也有些多肽,，特別是短肽，由于親水性強(qiáng),，在C18上保留很弱,，需要改變條件，這里主要有兩種方法：一個(gè)改變分析梯度,，可以將起始梯度改為2%,，等度或小梯度洗脫；另外一個(gè)方法是在流動(dòng)相中加入強(qiáng)離子對(duì)試劑,，如七氟丁酸,，十八烷基磺酸鈉等。