關(guān)鍵詞:基因的克隆與表達(dá)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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基因的克隆與表達(dá)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
從不同的重組DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子中鑒定出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子即陽性克隆的過程就是篩選,。目前發(fā)展起來的成熟篩選方法如下：
（一）插入失活法
外源DNA段插入到位于篩選標(biāo)記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點(diǎn)后，會(huì)造成標(biāo)記基因失活,，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化子相應(yīng)的抗生素抗性消失或轉(zhuǎn)化子顏色改變,，通過這些可以初步鑒定出轉(zhuǎn)化子是重組子或非重組子。目前常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍(lán)白篩選法,。
（二）PCR篩選和限制酶酶切法
提取轉(zhuǎn)化子中的重組DNA分子作模板,，根據(jù)目的基因已知的兩端序列設(shè)計(jì)特異引物,，通過PCR技術(shù)篩選陽性克隆。PCR法篩選出的陽性克隆,，用限制性內(nèi)切酶酶切法進(jìn)一步鑒定插入片段的大小,。
（三）核酸分子雜交法
制備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉(zhuǎn)化子中篩選目的克隆,。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達(dá)蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因,。
（四）免疫學(xué)篩選法
獲得目的基因表達(dá)的蛋白抗體，就可以采用免疫學(xué)篩選法獲得目的基因克隆,。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達(dá)蛋白抗體,，也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達(dá)載體中獲得表達(dá)蛋白的抗體。
奇妙的克隆克隆技術(shù)已展示出廣闊的應(yīng)用前景,，概括起來大致有以下四個(gè)方面：
（1）培育優(yōu)良畜種和生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,；
（2）生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；
（3）生產(chǎn)人胚胎干細(xì)胞用于細(xì)胞和組織替代療法,；
（4）復(fù)制瀕危的動(dòng)物物種,，保存和傳播動(dòng)物物種資源。
表達(dá)策略：1 反向遺傳學(xué)：克隆的CDS可以亞克隆到特定的表達(dá)載體,，并轉(zhuǎn)基因到特定的物種（如果本物種的轉(zhuǎn)基因體系尚未建立或很困難，可以先轉(zhuǎn)入一些模式生物）,，按需要在各種啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下在生物體內(nèi)表達(dá),，觀察表型；同時(shí)可以根據(jù)該CDS序列,，設(shè)計(jì)RNAi載體,，轉(zhuǎn)基因，觀察表型,。如果需要,，可以克隆該基因本身的啟動(dòng)子，然后讓其驅(qū)動(dòng)該基因或RNAi片斷表達(dá),。
2 體外表達(dá)：可以利用大腸桿菌,、酵母系統(tǒng)，在體外做一些原核或真核的表達(dá),。用以研究酶活,，制備抗體等。
基因克隆過程:１,、 獲得待克隆的DNA段（基因）,；
２、 目的基因與載體在體外連接,；
３,、 重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；
４、 篩選,、鑒定陽性重組子,；
５、 重組子的擴(kuò)增與／或表達(dá),。