關(guān)鍵詞:滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計經(jīng)驗及實驗操作技巧,，承諾客戶不成功不收費,。我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復(fù)我們的實驗結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：   http://www.,。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>一、實驗材料準(zhǔn)備
1.   滑膜組織：將外科手術(shù)切下的組織在手術(shù)臺上請將標(biāo)本放入低溫生理鹽水中,，在手術(shù)完成時將標(biāo)本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中帶回實驗室,。
2.   試劑：4 mg/mlⅠ型膠原酶(α-MEM配制)，培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的α-MEM),。
3.   器械：手術(shù)器械,。
二、方法
1.   將切下的組織在手術(shù)臺上請將標(biāo)本放入低溫生理鹽水中(靜止),，在手術(shù)完成時將標(biāo)本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中帶回實驗室,。
2.  在超凈臺中將標(biāo)本放入培養(yǎng)皿中,，加入α-MEM洗滌。
3.  獲得組織切開,，仔細(xì)辨認(rèn)于關(guān)節(jié)反折處及增生的白色光滑的滑膜組織,，附于關(guān)節(jié)軟骨面的增生的血管翳也為滑膜組織(可作另一管消化)，仔細(xì)剔除脂肪組織,，用α-MEM洗二次(以去除紅細(xì)胞),，放在小青瓶中用解剖剪銳性切碎。
4.   用雙倍獲得組織的體積含有4 mg/mlⅠ型膠原酶的α-MEM消化37℃孵育120分鐘(在此期間震動混勻數(shù)次)
5.   30分鐘后收集*管細(xì)胞：細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾,，用1500-2000轉(zhuǎn)離心6分鐘,，上清為Ⅰ型膠原酶加入未過濾網(wǎng)的組織，繼續(xù)用于消化,。
6.   離心管底細(xì)胞用α-MEM離心洗滌2次,，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000轉(zhuǎn)，離心6分鐘,，zui后一次用記數(shù)板觀察到有細(xì)胞,。細(xì)胞zui終懸浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),。
7.  60鐘后收集第二管細(xì)胞：細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾,，用1500-2000 rpm離心6分鐘；用α-MEM洗2次,，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000 rpm離心6分鐘,，zui后一次用記數(shù)板觀察細(xì)胞并計數(shù)。細(xì)胞zui終懸浮于α-MEM含有10%胎牛血清中,，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),。
8.   必要時可做第三管細(xì)胞收集；并立即作原代滑膜細(xì)胞培養(yǎng),。
9.  每2-3天換液一次,。
實驗材料：
1. 實驗動物：大鼠、兔,，人手術(shù)切除的關(guān)節(jié)等,；
2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg 2+ 的1×PBS，添加100IU/ml青霉素,、100μg/ml鏈霉素,，pH7.2；
3. 培養(yǎng)液：RPMI1640培養(yǎng)基,，補(bǔ)加15%小牛血清,；
實驗方法：
1. 將大鼠處死后，用75%酒精消毒,；
2. 用手術(shù)剪剖開其四肢皮膚與肌肉,，暴露長骨兩端的關(guān)節(jié),，取出關(guān)節(jié)面滑膜組織置于盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中；
3. 剔除滑膜組織外層結(jié)構(gòu)及周邊軟骨組織,，用緩沖液洗2—3次,；
4. 將滑膜組織置于盛有少量小牛血清的培養(yǎng)皿中，剪碎成1mm×1mm×1mm大小的植塊,；
5. 將制備的植塊接種到螺旋口培養(yǎng)瓶中,。反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使植有組織塊的一面朝上,，加入培養(yǎng)液,，蓋好瓶蓋。將培養(yǎng)瓶放入含5%CO2的培養(yǎng)箱中在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng),；
6. 培養(yǎng)4h后,，組織塊較牢黏附于瓶底時，再輕輕反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,，繼續(xù)培養(yǎng),；
7. 培養(yǎng)3d后換培養(yǎng)液。
注意事項    
1.   用0.25% trypsin或0.25% trypsin＋ 0.02% EDTA 或 collagenaseⅠ或collagenaseⅡ消化細(xì)胞或合用,，只有單用collagenaseⅠ有用,、；
2.   機(jī)械法很難獲得細(xì)胞,；
3.  全培用α-MEM或RPMI1640或DMEM,，加10%胎牛血清。不能用小牛血清,，胎牛血清用國產(chǎn)即可,；
4.  必須用Ca2+-free的PBS。