關(guān)鍵詞:TUNEL檢測技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌TUNEL檢測技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
TUNEL檢測技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設(shè)計經(jīng)驗及實驗操作技巧,，承諾客戶不成功不收費,。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時,，我們也會提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費精力重復(fù)實驗,。另一方面,，我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復(fù)我們的實驗結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌：   http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>器材與試劑
1,、器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng),、搖床,、組化筆、小型染色缸,、濕盒（塑料飯盒與紗布）,、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的移液器及槍頭等,。
2,、試劑：試劑盒含TdT 2×、Biotinylated標記的dUTP,、標記streptavidin的HRP,、SSC 20×、Proteinase k,、DAB 20×,、DAB底物Buffer 20×、H2O2 20×,；
自備試劑：
（1）1×PBS（pH 7.4,，2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4），115℃×15 min,；
（2）0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水,，115 ℃×15 min；
（3）4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多,，再放入4 ℃保存,。
（4）DNase I buffer：40 mM Tris-HCl （pH 7.9）+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2；
（5）Proteinase K buffer：100 mM Tris-HCl （pH 8.0）+50 mM EDTA,；
（6）DNase 1（原液1000 U/ml按1：99DNase 1緩沖液稀釋至10 U/ml）,；
（7）DAB工作液（臨用前配制，5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS）
（8）20 μg/ml Proteinase K工作液（按1：500稀釋貯存液1 mg/ml）,。
（9）另外,，雙蒸水、無菌0.85%NaCl,、二甲苯,、梯度乙醇（100、95,、85,、70、50%）,、蘇木素,。
實驗步驟
1、脫蠟：用二甲苯浸洗5 min×2次,；
2,、水化：用梯度乙醇（100%×5 min、100%×3 min,、95%×3 min,、85%×3 min,、70%×3 min、50%×3 min）,；
3,、浸洗：0.85%NaCl×5 min?PBS洗5 min；
4,、固定：浸入4%多聚甲醛15 min,；
5、浸洗：PBS 5 min×2次,；
6,、細胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K處理組織15（10~30） min RT；
7,、浸洗：PBS洗5 min,；
8、固定： 浸入4%多聚甲醛5 min,；
9,、浸洗：PBS 5 min×2次；
10,、平衡：加100 ul平衡液,，濕盒平衡10（5~10） min；
11,、制備TUNEL反應(yīng)混合液：處理組用1ul rTdT+1ul 生物素標記的dUTP+98 ul平衡液混勻,；而陰性對照組不加rTdT，改為三蒸水,；陽性對照組先加入100ul DNase 1 緩沖液孵育5 min,，甩掉液體后再加100 ul DNase 1（10 U/ml）酶切10 min，用去離子水沖洗4次,，PBS浸洗5 min,，后面步驟從第10步開始。
12,、標記反應(yīng)：加100ul TUNEL反應(yīng)混合液于標本上,，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37 ℃×1 h。
13,、終止反應(yīng)：浸入2×SSC 15 min,；
14、浸洗：PBS 5 min×3次,；
15,、封閉POD：浸入0.3%H2O2 15 min；
16,、浸洗：PBS 5 min×3次,；
17,、酶標反應(yīng)：加100 ul streptavidin標記HRP（按1：500 PBS稀釋）30 min,；
18,、浸洗：PBS 5 min×3次；
19,、DAB顯色（避光）：加100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB底物緩沖液+50 ul H2O220×+950 ul三蒸水）10 min左右,，鏡下出現(xiàn)淺棕色背景時。
20,、用去離子水沖洗幾次,；
21、用蘇木素復(fù)染,，3 s左右后立即用自來水沖洗,。梯度酒精脫水（50、70,、85,、95、100,、100%各1 min）,、二甲苯透明1 min×2次、中性樹膠封片,。
22,、加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細胞（共計200~500個細胞）并拍照,?？山Y(jié)合凋亡細胞形態(tài)特征來綜合判斷（未染色細胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,，晚期出現(xiàn)凋亡小體,，貼壁細胞出現(xiàn)鄒縮、變圓,、脫落,；而染色細胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化,，核膜裂解,，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）。
注意事項:
1,、結(jié)果分析時注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞中可產(chǎn)生大量DNA片斷,，從而引起假陽性結(jié)果；而有些類型的凋亡性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不*,，以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞內(nèi)反應(yīng),，進而產(chǎn)生假陰性結(jié)果,。
2、初次檢測細胞凋亡,，設(shè)置陽性對照片,。
3、血細胞含量高的組織,，盡可能延長過氧化氫的滅活時間,。
4、蘇木素的復(fù)染時間需要摸索,。
5,、每片所加試劑可調(diào)整，一般30~100 ul不等,，但也要防止液體揮發(fā)而干片,，且反應(yīng)均在放置濕盒內(nèi)。