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冷凍干燥與液氮保藏菌種技術
建議用下列方法恢復培養(yǎng)冷凍干燥保藏的菌種。
一、安瓶管開封 ：
1.用浸過70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管。
2.用火焰將安瓿管頂端加熱,。
3.滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂。
4.用挫刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端,。
二,、菌株恢復培養(yǎng) ：
1.用無菌吸管，吸取0.3～0.5ml適宜的液體培養(yǎng)基,，滴人安瓿管內(nèi),，輕輕振蕩，使凍于菌體溶解呈懸浮狀,。
2.取0.1～0.2ml菌體懸浮液,，移植于適宜的瓊脂斜面/平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液,，注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi),，然后在建議的溫度下培養(yǎng)。
3.若未能活化,，或活化后有疑問時,，請于收到菌種1個月內(nèi)，通知保藏中心，經(jīng)查證無誤后,，即免費補寄,。
三、注意事項 ：
1.菌種活化前,，請將安瓿管保存在6一10℃的環(huán)境下。
2.厭氧菌的培養(yǎng),，如無特別說明,，自開封至接種完成，均需以無氧氣體充填,，以保持厭氧狀態(tài),。
3.某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后，延遲期較長,，需連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長,，此時請將步驟二(2)重復一次。
< 液氮超低溫保藏程序 >
1,、容器的選擇：使用帶螺旋蓋的2ml塑料安培瓶,。
2、檢查安培瓶是否滲漏：用0.05%的亞甲基藍水溶液在4℃浸泡30-45分鐘,，沖洗干凈,，棄去含有藍色染料的安培瓶，其余的安培瓶備用,。
3,、打印標簽(激光打印)。
4,、容器的滅菌：先用蒸餾水漂洗干凈安培瓶,，再用蒸餾水在滅菌鍋中121℃浸泡滅菌15分鐘，干燥并將打印好的標簽放入安培瓶中,，略擰緊螺旋蓋,，再行121℃滅菌30分鐘。
5,、保藏菌菌齡：處于zui大生長量階段或?qū)?shù)生長期后期,。
6、保護劑：選用5-10%的甘油或二甲基亞砜作保護劑,。
1)甘油的準備：在121℃滅菌15分鐘,，2-8℃貯存。甘油一般以兩倍zui終所需濃度的水溶液保存,，然后與同等量的細胞懸液混合,。若不用細胞懸液，則以zui終所需濃度的水溶液保存。
2)二甲基亞砜：用0.22um的聚四氟乙烯過濾膜過濾除菌,。過濾膜預先用甲醇和二甲基亞砜漂洗,。無菌的二甲基亞砜以10-15ml裝量2-8℃避光保存。
7,、分裝：在無菌條件下,，將細胞懸液(從平板上打下直徑為5cm的菌塊)分裝于安培瓶中，并注入保護劑,，擰緊螺旋蓋,。 傳代細胞
8、將安培瓶固定在鋁夾上,，貼好標簽,。為了便于取用，一般一個鋁夾上僅放一個菌株,。
9,、將控溫系統(tǒng)先預冷到4℃，再將鋁夾放入其中,。以每分鐘1℃降溫至-40℃,，然后以每分鐘10℃降溫至-90℃。降溫以后,，將鋁夾轉(zhuǎn)移至處于液氮中的儲存器中保存,。
10、菌種的復活：將液氮保藏的菌種取出,，迅速放入37℃水浴中解凍,。一般需2至2.5分鐘,等*解凍后，再及時轉(zhuǎn)接到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),。
一、安瓶管開封 ：
1.用浸過70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管。
2.用火焰將安瓿管頂端加熱,。
3.滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂。
4.用挫刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端,。
二,、菌株恢復培養(yǎng) ：
1.用無菌吸管，吸取0.3～0.5ml適宜的液體培養(yǎng)基,，滴人安瓿管內(nèi),，輕輕振蕩，使凍于菌體溶解呈懸浮狀,。
2.取0.1～0.2ml菌體懸浮液,，移植于適宜的瓊脂斜面/平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液,，注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi),，然后在建議的溫度下培養(yǎng)。
3.若未能活化,，或活化后有疑問時,，請于收到菌種1個月內(nèi)，通知保藏中心，經(jīng)查證無誤后,，即免費補寄,。
三、注意事項 ：
1.菌種活化前,，請將安瓿管保存在6一10℃的環(huán)境下。
2.厭氧菌的培養(yǎng),，如無特別說明,，自開封至接種完成，均需以無氧氣體充填,，以保持厭氧狀態(tài),。
3.某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后，延遲期較長,，需連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長,，此時請將步驟二(2)重復一次。
< 液氮超低溫保藏程序 >
1,、容器的選擇：使用帶螺旋蓋的2ml塑料安培瓶,。
2、檢查安培瓶是否滲漏：用0.05%的亞甲基藍水溶液在4℃浸泡30-45分鐘,，沖洗干凈,，棄去含有藍色染料的安培瓶，其余的安培瓶備用,。
3,、打印標簽(激光打印)。
4,、容器的滅菌：先用蒸餾水漂洗干凈安培瓶,，再用蒸餾水在滅菌鍋中121℃浸泡滅菌15分鐘，干燥并將打印好的標簽放入安培瓶中,，略擰緊螺旋蓋,，再行121℃滅菌30分鐘。
5,、保藏菌菌齡：處于zui大生長量階段或?qū)?shù)生長期后期,。
6、保護劑：選用5-10%的甘油或二甲基亞砜作保護劑,。
1)甘油的準備：在121℃滅菌15分鐘,，2-8℃貯存。甘油一般以兩倍zui終所需濃度的水溶液保存,，然后與同等量的細胞懸液混合,。若不用細胞懸液，則以zui終所需濃度的水溶液保存。
2)二甲基亞砜：用0.22um的聚四氟乙烯過濾膜過濾除菌,。過濾膜預先用甲醇和二甲基亞砜漂洗,。無菌的二甲基亞砜以10-15ml裝量2-8℃避光保存。
7,、分裝：在無菌條件下,，將細胞懸液(從平板上打下直徑為5cm的菌塊)分裝于安培瓶中，并注入保護劑,，擰緊螺旋蓋,。 傳代細胞
8、將安培瓶固定在鋁夾上,，貼好標簽,。為了便于取用，一般一個鋁夾上僅放一個菌株,。
9,、將控溫系統(tǒng)先預冷到4℃，再將鋁夾放入其中,。以每分鐘1℃降溫至-40℃,，然后以每分鐘10℃降溫至-90℃。降溫以后,，將鋁夾轉(zhuǎn)移至處于液氮中的儲存器中保存,。
10、菌種的復活：將液氮保藏的菌種取出,，迅速放入37℃水浴中解凍,。一般需2至2.5分鐘,等*解凍后，再及時轉(zhuǎn)接到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),。