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1、細(xì)胞復(fù)蘇
將凍存細(xì)胞從液氮中取出后,，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化,。將融化的細(xì)胞移入離心管中，加入37℃預(yù)熱的DMEM*培養(yǎng)基中（其中胎牛血清約為10%）,，輕輕吹勻,，離心，500g離心2min,，棄上清液,。

加入DMEM*培養(yǎng)基清洗，棄上清液,。加入DMEM*培養(yǎng)基,，輕輕吹打混勻，制成細(xì)胞懸液,，接種于培養(yǎng)皿/瓶中,，在含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

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2,、細(xì)胞傳代
當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%（過(guò)早產(chǎn)量不足,，過(guò)晚細(xì)胞狀態(tài)不佳，1:2至1:10以上的比率傳代培養(yǎng),，一般1:3至1:5細(xì)胞一代，即從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間,，非細(xì)胞有絲分裂次數(shù)）時(shí),，去掉*培養(yǎng)基，用1X PBS清洗2次,。

加入胰蛋白酶（注意：消化液的量以蓋住細(xì)胞較好,，容易消化溫度是37℃。顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀(guān)察消化細(xì)胞,，若胞質(zhì)回縮,，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度）進(jìn)行消化,，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中約2-3min,。

加入適量DMEM*培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至離心管后500g離心2min，棄上清液,，再加入DMEM*培養(yǎng)基清洗,，棄上清液。

加入DMEM*培養(yǎng)基,，輕輕吹打混勻,，吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后按照所需細(xì)胞量在含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),。

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3,、細(xì)胞凍存
當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)，去掉*培養(yǎng)基,，用1X PBS清洗2次,。加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中約2-3min,。加入DMEM*培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化,，轉(zhuǎn)移至離心管后500g離心2min，棄上清液,，再加入DMEM*培養(yǎng)基清洗,，棄上清液。加入lml凍存液（90%胎牛血清,，10%DMSO,。 一般來(lái)講血清含量可以在10%-90%之間調(diào)整，凍存液中加入血清一方面可以為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng),，另一方面可以在細(xì)胞凍存過(guò)程中提供非滲透性保護(hù)物質(zhì),，如蔗糖，白蛋白等從而更好地保護(hù)細(xì)胞）,，放入凍存管內(nèi)（管內(nèi)有異丙醇,，以保證溫度降低的速度），立即放入4℃冰箱中凍存30min,，然后放入-20℃冰箱中凍存30min,，再置于-80℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。

第二天放入液氮中,，可以保存至少兩年,，如不放人液氮，可以保存三個(gè)月,。 

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的原則是：慢凍速融,，這樣更加有利于保持細(xì)胞的活力。凍存細(xì)胞不加任何保護(hù)劑,，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生,，從而使細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性的機(jī)械損傷,，引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境滲透壓，PH,，電解質(zhì)等的改變,，進(jìn)而促使細(xì)胞死亡。

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凍存管

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4,、注意事項(xiàng)

（1）預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液,、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱；
（2）用75%酒精擦拭經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)照射的超凈工作臺(tái)和雙手,；
（3）正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間,，不僅便于操作而且減少污染；
（4）點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太??；
（5）嚴(yán)格的無(wú)菌操作；
（6）貼壁細(xì)胞消化適度：消化的時(shí)間受消化液的種類(lèi),、配制時(shí)間,、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化,，一旦胞質(zhì)回縮,，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化,；
（7）傳代細(xì)胞所有的操作盡量靠近酒精燈火焰,。每次只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作，每種細(xì)胞使用一套器材,。避免交叉感染,；
（8）傳代細(xì)胞瓶口每次打開(kāi)或者關(guān)閉都需要在酒精燈上消毒。

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶

貼壁細(xì)胞微載體培養(yǎng)瓶

貼壁細(xì)胞滾瓶培養(yǎng)