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        線粒體檸檬酸含量測(cè)試定試劑盒 微量法

測(cè)定意義：CA是線粒體三羧酸循環(huán)的*個(gè)中間產(chǎn)物，由檸檬酸合酶催化乙酰CoA與草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循環(huán)強(qiáng)度的主要指標(biāo)之一,。

測(cè)定原理：CA在檸檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）,；在弱酸性條件下,，α-酮酸進(jìn)一步與苯肼反應(yīng)，生成相應(yīng)的α-酮酸苯腙,；α-酮酸苯腙在330nm處有吸收峰,，該波長(zhǎng)下吸光度的變化程度可反映出CA的含量。

需要的儀器,，耗材:可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、水浴鍋、可調(diào)式移液槍,、微量石英比色皿/96孔板,、研缽、蒸餾水,。 

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試劑組成和配制：酸性提取液：液體 100mL×1 瓶,，4℃保存。堿性提取液：液體 100mL×1 瓶,，4℃保存,。試劑一：液體 6mL×1 瓶，4℃保存,。試劑二：液體 2mL×1 瓶,，4℃保存,。試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存,；臨用前加入 6mL 蒸餾水充分溶解待用,；用不完的試劑 4℃保存；標(biāo)準(zhǔn)液：液體 1mL×1 支,，10μmol/mL 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液,，4℃保存。

線粒體中檸檬酸提?。悍Q 0.05~0.1g 樣品（建議稱 0.1g 樣本）,，加入 0.5mL 酸性提取液，冰上充分研磨,，600g/min 4℃ 離心 5min,；取上清另一 EP 管中，11000g/min 4℃離心 10min,，棄上清（取 300μL 該上清液和 300μL 堿性提取液中和后可用于細(xì)胞質(zhì) CA 含量測(cè)定）,；沉淀即線粒體，向沉淀中加入 0.5mL 酸性提取液,，充分懸浮溶解,，超聲波破碎（功率 20％，超聲 3 秒,，間隔 10 秒,，重復(fù) 30 次），取此溶液 300μL 和 300μL 堿性提取液中和,，混勻,，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。測(cè)定步驟： 1,、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 330nm，蒸餾水調(diào)零,。 2,、試劑一、二和三 37℃預(yù)熱 10min,。 3、樣本測(cè)定：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要各做一個(gè),。試劑名稱(μL) 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 測(cè)定管試劑一 60 60 60 蒸餾水 60 標(biāo)準(zhǔn)液 60 樣本 60 試劑二 20 20 20 試劑三 60 60 60 充分混勻,，330nm 立即測(cè)定初始吸光值 A1 和 37℃孵育 30min 后的吸光值 A2，ΔA=A2 –A1,。檸檬酸含量計(jì)算：（1）按蛋白濃度計(jì)算檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管) ×V 樣]÷（V 樣÷Cpr）=10×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管)÷Cpr 蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定,。（2）按樣本鮮重計(jì)算檸檬酸含量(μ mol/g鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA測(cè)定管－ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA空白管) ×V 樣]÷（W×V 樣÷V 樣總）=10×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管)÷W C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)液濃度,，10μmol/mL； V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積：0.06mL,；V 樣總：加入提取液體積：1mL,；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g。注意：檢測(cè)限為 10nmol/mg prot 或 1μmol/g 鮮重,。

 相關(guān)文獻(xiàn)：

《Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis》 作者:Meixi Peng, Dan Yang, Yixuan Hou, Shuiqing Liu, Maojia Zhao, Yilu Qin, Rui Chen, Yong Teng & Manran Liu 期刊:Cell Death and Disease 影響因子:5.959 PMID:30850587