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狗外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒
本品用于分離狗外周血單核細(xì)胞,。
本品易感染細(xì)菌,,需無菌條件操作,。無菌條件下操作,,啟封后置常溫保存,。如 4℃保存,,本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,,影響分離效果。
狗外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒
操作步驟: 1. 取新鮮抗凝全血(EDTA,、枸櫞酸鈉或肝素抗凝血均可)或者去纖維蛋白血液,,用等體積的全血及組織稀釋液或者PBS稀釋全血。 2. 取一支無菌離心管,,先加入試劑A,,再加入試劑D,使兩者形成梯度界面(試劑A:試劑D的體積比為3:2,如稀釋后的血液樣本小于5ml,,則先后加入3ml試劑A和2ml試劑D,;如稀釋后的血液樣本大于5ml,試劑總量與稀釋后的血液樣本量相等),,兩種試劑的分層一定要清晰,。 3. 將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方,注意保持兩液面界面清晰,。(可以使用巴氏德吸管吸取血液,,然后將血液小心的平鋪于分離液上,因?yàn)閮烧叩拿芏炔町?,將形成明顯的分層界面,。如果樣品較多,加樣的時間較長,,在離心之前出現(xiàn)紅細(xì)胞成團(tuán)下沉屬正?,F(xiàn)象) 4. 室溫,水平轉(zhuǎn)子500~800g,,離心20~30min(血液的體積越大所需的離心力越大,,離心時間越長,分離條件需自行摸索,,離心轉(zhuǎn)速不超過1000g)。 5. 離心后將出現(xiàn)明顯的分層: 層為血漿層,;第二層為白色單核細(xì)胞層,;第三層為透明試劑D液層;第四層為半透明試劑A液層,;第五層為紅細(xì)胞層(如圖示),。 6. 小心吸取第二層試劑D層和第三層乳白色細(xì)胞層到另一無菌的15ml離心管中,加入10mL細(xì)胞洗滌液或PBS,,顛倒混勻,,250g,離心10min,。 7. 棄上清,,5mL的細(xì)胞清洗液或PBS重懸細(xì)胞,250g,,離心10min,。 8. 重復(fù)步驟7 9. 棄上清,細(xì)胞重懸備用,。 10. 差異貼壁法純化細(xì)胞:用單核細(xì)胞培養(yǎng)基以10 6個/ml的密度重懸細(xì)胞,,將細(xì)胞鋪于細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。 1) 2~4 h內(nèi)貼壁的為單核細(xì)胞,。 2) 10~24 h內(nèi)貼壁的單個核細(xì)胞為內(nèi)皮,、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞 ,。 3) 不貼壁的為淋巴細(xì)胞,。根據(jù)不同細(xì)胞的貼壁時間存在差異,以達(dá)到簡單純化單核細(xì)胞的目的,。此法成本低,,操作簡便。如需獲得高純度的目的細(xì)胞則需選用免疫磁珠分選或者是應(yīng)用流式技術(shù)分選細(xì)胞,。
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