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狗外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒

本品用于分離狗外周血單核細(xì)胞,。

本品易感染細(xì)菌,，需無(wú)菌條件操作,。無(wú)菌條件下操作,，啟封后置常溫保存,。如 4℃保存,，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,，影響分離效果。

狗外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒

操作步驟： 1. 取新鮮抗凝全血（EDTA,、枸櫞酸鈉或肝素抗凝血均可）或者去纖維蛋白血液,，用等體積的全血及組織稀釋液或者PBS稀釋全血。 2. 取一支無(wú)菌離心管,，先加入試劑A,，再加入試劑D，使兩者形成梯度界面（試劑A：試劑D的體積比為3：2,，如稀釋后的血液樣本小于5ml,，則先后加入3ml試劑A和2ml試劑D；如稀釋后的血液樣本大于5ml,，試劑總量與稀釋后的血液樣本量相等）,，兩種試劑的分層一定要清晰。 3. 將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方,，注意保持兩液面界面清晰,。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后將血液小心的平鋪于分離液上,，因?yàn)閮烧叩拿芏炔町?，將形成明顯的分層界面。如果樣品較多,，加樣的時(shí)間較長(zhǎng),，在離心之前出現(xiàn)紅細(xì)胞成團(tuán)下沉屬正常現(xiàn)象） 4. 室溫,，水平轉(zhuǎn)子500~800g,，離心20~30min（血液的體積越大所需的離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng),，分離條件需自行摸索,，離心轉(zhuǎn)速不超過(guò)1000g）。 5. 離心后將出現(xiàn)明顯的分層： 層為血漿層,；第二層為白色單核細(xì)胞層,；第三層為透明試劑D液層；第四層為半透明試劑A液層；第五層為紅細(xì)胞層（如圖示）,。 6. 小心吸取第二層試劑D層和第三層乳白色細(xì)胞層到另一無(wú)菌的15ml離心管中,，加入10mL細(xì)胞洗滌液或PBS，顛倒混勻,，250g,，離心10min。 7. 棄上清,，5mL的細(xì)胞清洗液或PBS重懸細(xì)胞,，250g，離心10min,。 8. 重復(fù)步驟7 9. 棄上清,，細(xì)胞重懸備用。 10. 差異貼壁法純化細(xì)胞：用單核細(xì)胞培養(yǎng)基以10 6個(gè)/ml的密度重懸細(xì)胞,，將細(xì)胞鋪于細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中,，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。 1) 2~4 h內(nèi)貼壁的為單核細(xì)胞,。 2) 10~24 h內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮,、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞 ,。 3) 不貼壁的為淋巴細(xì)胞,。根據(jù)不同細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異，以達(dá)到簡(jiǎn)單純化單核細(xì)胞的目的,。此法成本低,，操作簡(jiǎn)便,。如需獲得高純度的目的細(xì)胞則需選用免疫磁珠分選或者是應(yīng)用流式技術(shù)分選細(xì)胞,。