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堿性磷酸酶染色液(偶氮偶聯(lián)法)

自備材料：
1、載玻片、濕盒
2,、普通光學(xué)顯微鏡
產(chǎn)品簡介
       堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，簡稱 ALP 或 AKP)為一類磷酸酯酶,，廣泛分布于哺乳動物組
織內(nèi),，其活性所需適 pH 9.2~9.8。此酶主要存在于物質(zhì)交換活躍之處(細(xì)胞膜),，如腸上皮和腎近曲小管的刷狀緣,、附睪上皮之靜纖毛、肝的毛細(xì)膽管膜以及微動脈和毛細(xì)血管動脈部之內(nèi)皮,，還見于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),、高爾基復(fù)合體、吞飲小泡,、腸上皮之溶酶體,、中性粒細(xì)胞之中性顆粒以及平滑肌之細(xì)胞膜。不是采用金屬沉淀法來顯示堿性磷酸酶活性,，而是采用偶氮偶聯(lián)法(又稱同時偶聯(lián)法),，其原理是在 pH9.2～9.8 的堿性條件下，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶可使 AB-BI 磷酸鹽水解,，釋放出磷酸與萘酚,，后者與偶聯(lián)重氮鹽生成有色產(chǎn)物，定位于細(xì)胞質(zhì)中,。該染液可用于血液,、骨髓或細(xì)胞涂片、冰凍切片、梯度入水后的石蠟切片等的堿性磷酸酶染色,，堿性磷酸酶活性部位呈藍(lán)色,，位于胞槳，結(jié)果較金屬鹽沉淀法可靠,。

操作步驟：
一,、涂片或切片
1、 血液,、骨髓或細(xì)胞涂片,、冰凍切片、石蠟切片入ALP固定液固定3min(梯度入水后的石蠟切片無需固定),，水洗,。
2、 滴加配制好的 ALP 孵育液,，放入濕盒中,，避光孵育 15～20min，水洗,。
3,、 入核固紅染色液或甲基綠染色液復(fù)染 3～5min。
4,、 水洗,、鏡檢或甘油明膠封固后鏡檢。
二,、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞
1,、 取6孔板或其他容器培養(yǎng)的細(xì)胞，棄液,，PBS清洗干凈,。
2、 加入ALP固定液固定3min或4%多聚甲醛固定10～15min,，PBS清洗,。
3、 滴加配制好的 ALP 孵育液,，放入濕盒中,，避光孵育 15～20min，PBS 清洗,。
4,、 入核固紅染色液或甲基綠染色液復(fù)染 3～5min。
5,、 PBS 清洗,、鏡檢,。

染色結(jié)果：
ALP 活性部位 藍(lán)色
細(xì)胞核 紅色(核固紅)或綠色(甲基綠)
血液、骨髓涂片結(jié)果判斷：
一般以積分報告結(jié)果,，根據(jù) 100 個中性粒細(xì)胞陽性顆粒進(jìn)行 0-4 計分,。
細(xì)胞分值 染色特點(diǎn)
0 無顆粒
1 稍有顆粒
2 中等程度顆粒
3 多數(shù)顆粒
4 充滿顆粒

注意事項：
1. 血液或骨髓細(xì)胞涂片或其他樣本均應(yīng)新鮮，薄厚適宜,，及時固定,，否則會影響酶的活性。
2. 培養(yǎng)細(xì)胞染色操作過程中,，清洗、染色等步驟都應(yīng)輕微,，以免損傷或丟失細(xì)胞,。
3. ALP 孵育液易失效或降低陽性強(qiáng)度，即配即用,，不宜久置,。
4. 復(fù)染時，核固紅染色液或甲基綠染色液二者取其一,。
5. 每次染色時,，應(yīng)有陽性對照片。

相關(guān)文獻(xiàn)：

《Hedgehog pathway inhibition causes primary follicle atresia and decreases female germline stem cell proliferation capacity or stemness》 作者:Yu Jiang, Dantian Zhu, Wenfeng Liu, Qiushi Qin, Zhi Fang and Zezheng Pan 期刊:Stem Cell Research & Therapy 影響因子:4.627 PMID:31277696

堿性磷酸酶染色液(偶氮偶聯(lián)法)