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磷酸果糖激酶(PFK)活性檢測試劑盒

操作步驟：

一、樣本的前處理

1,、 細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10 4個）提取液體積（mL）為 500-1000： 1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率 20％或者 200W，超聲 3s,，間隔 10s,，重復(fù) 30 次）,；8000g 4℃離心 10min，取上清,，置冰上待測,。

2、 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為 1:5-10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1mL 提取液）,，進行冰浴勻漿；8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

3,、 血清（漿）樣品：直接檢測,。

二、測定步驟：

1. 分光光度計預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長 340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 樣本測定（1） 在試劑二瓶中加入 17ml 試劑一和 1.13ml 蒸餾水充分溶解,，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）水浴 5 分鐘,。用不完的試劑 4℃保存一周。（2） 在試劑三中加入 1ml 蒸餾水充分混勻,，冰上放置備用,；用不完的試劑 4℃保存一周。（3） 在試劑四中加入 1ml 蒸餾水充分混勻,，冰上放置待用,；用不完的試劑 4℃保存一周。（4） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本,、10μl 試劑三,、10μl 試劑四和 170μl 試劑二，混勻,，立即記錄 340nm 處 20s 時的吸光值 A1 和 10min20s 后的吸光值 A2,，計算ΔA=A1-A2。

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PFK 活力單位的計算：用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

1,、 血清（漿）PFK 活力的計算: 單位的定義：每毫升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖 -1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位,。 PFK（U/mL）=[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷V 樣÷T=321×△A

2、 組織,、細菌或細胞中 PFK 活力的計算: （1） 按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6- 二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位,。 PFK（U/mg prot）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(Cpr×V 樣)÷T=321×△A ÷Cpr （2） 按樣本鮮重計算單位的定義：每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位。 PFK（U/g 鮮重）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=321×△A ÷W （3） 按細菌或細胞密度計算單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位。 PFK（U/10 4 cell）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.642×△A V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10 -4L,；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10 3L/mol/cm,；d：比色皿光徑,，1 cm；V 樣：加入樣本體積,，0.01mL,；V 樣總：加入提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時間,，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,； W：樣本質(zhì)量，g,；500：細菌或細胞總數(shù),，500 萬。

用 96 孔板測定的計算公式如下：

1 血清（漿）PFK 活力的計算: 單位的定義：每毫升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖 -1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位,。 PFK（U/mL）=[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷V 樣÷T=642×△A 2 組織,、細菌或細胞中 PFK 活力的計算: （4） 按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6- 二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位。 PFK（U/mg prot）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(Cpr×V 樣)÷T=642×△A ÷Cpr （5） 按樣本鮮重計算單位的定義：每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位,。 PFK（U/g 鮮重）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=642×△A ÷W （6） 按細菌或細胞密度計算單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位,。 PFK（U/10 4 cell）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=1.284×△A V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10 -4L,；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10 3L/mol/cm；d：比色皿光徑,，0.5 cm,；V 樣：加入樣本體積,，0.01mL,；V 樣總：加入提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時間,，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,， mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細菌或細胞總數(shù),，500 萬,。

磷酸果糖激酶(PFK)活性檢測試劑盒

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存,；試劑一：液體 20mL×1 瓶,，4℃保存；試劑二：粉劑×1 瓶,，-20℃保存,。試劑三：粉劑×1 支，4℃保存,。試劑四：液體×1 支,，4℃保存