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Human IL-6 ELISA試劑盒

人白細胞介素6ELISA 試劑盒
產(chǎn)品編號：SEKH-0013
適用于人血清,、血漿或細胞培養(yǎng)上清液等樣本

背景介紹：
     白細胞介素 6(IL-6)是一種由淋巴、非淋巴細胞產(chǎn)生的多功能細胞因子。人 IL-6 的 cDNA 序列有 212 個 氨基酸殘基,，含兩個潛在的 N -糖基化位點。成熟 IL-6 由疏水 N 末端 28 個氨基酸殘基信號肽裂解產(chǎn)生,，含 184 氨基酸殘基,，其中有四個半胱氨酸殘基，分子量為 21 kDa,。IL-6 由多種細胞產(chǎn)生,，對免疫應(yīng)答、急性 期反應(yīng),、造血和神經(jīng)系統(tǒng)有多方面作用,。IL-6 的生物學(xué)活性主要包括 6 個方面：調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)造血 系統(tǒng),、誘導(dǎo)急性期蛋白,、調(diào)節(jié)腫瘤生長、調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和其它,。

檢測原理：
      Solarbio (Solarbio ®) ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù),。將抗人 IL-6 單克 隆抗體包被在酶標(biāo)板上；分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本,，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的人 IL-6 會與酶標(biāo) 板上的包被抗體充分結(jié)合,；洗板后加入生物素化抗人 IL-6 抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品 和樣本中的人 IL-6 發(fā)生特異性結(jié)合,；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素,，生物素與鏈 霉親和素會發(fā)生高強度的非共價結(jié)合；洗板后加入顯色劑底物 TMB,，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的人 IL-6,， 則 HRP 會使無色 TMB 變成不同深淺（正相關(guān)）的藍色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會變成黃色,；后,，在 λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD），樣本中的人 IL-6 濃度與 OD 成正比,，通過 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計算出樣本中人 IL-6 的濃度,。

原理圖：

注意事項：
1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用,，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應(yīng)保存在 2-8℃冰箱,，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品,，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復(fù) 30 min,，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品,。
4. 在試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致,。
5. 為避免交叉污染,，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭,，封板膜（※）及潔凈塑料容器,。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上,，使用前請離心處理（5-10 S 即可）,，使管壁上的液體集中在管底部，取用時,，請用移液器小心吹打幾次,。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分,。
8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確,，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液,，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護,；在操作過程中也要避免試
劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸,，請用大量清水清洗,；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物
實驗室安全防護有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行,。

自備實驗器材（不提供,，可代購）
1． 酶標(biāo)儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水,，去離子水,，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管

樣本收集及儲存：
1. 細胞培養(yǎng)上清：
將細胞培養(yǎng)基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,，避免反復(fù)凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后,，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于
-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,，保存過程中如有沉淀，請再次離心,，避免反復(fù)凍融,。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實際要求選擇 EDTA,，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,，避免反復(fù)凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血,、高血脂樣本,，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高
于標(biāo)準(zhǔn)品的高值,，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測,，建議正式實驗前做預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù)。

試劑準(zhǔn)備：
1. 試劑回溫：先在實驗前 30 min 將試劑盒,，待測樣本放置于室溫下,，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入
37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解,。
2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積,，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存,。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,，靜置15分鐘待其*溶解后輕 輕混勻(濃度為1000pg/ml)，然后在其余七管中各加入500?1?78?1?76L標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）,，按照以下濃度 進行2倍稀釋：500,、250、125,、62.5,、31.25、15.62,、7.81 pg/ml進行稀釋,。500pg/ml為標(biāo)準(zhǔn)曲線高點 濃度，標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零點（0pg/ml）,。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（1000pg/ml） 未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝,，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖,。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗所需用量,，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍

應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻）,，請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制,，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1 倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心）,，請在30分鐘內(nèi)使用。

6. 洗滌方法： 

自動洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭吸水紙上拍干,，注入洗滌液為 300ul/孔,注 與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次,。 

手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔,，靜止 30 秒后甩 凈酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次,。

結(jié)果判斷：

1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值,。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm,。如不能進行雙波長檢測,，請 用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。

2.計算標(biāo)準(zhǔn)品,、樣品的平均 OD 值：每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值

3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，樣品中IL-6含量可通過對應(yīng)OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度,。

4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測,，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù),。

1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

本圖僅供參考，應(yīng)以當(dāng)次試驗標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算人 IL-6 的樣本含量

 

2. 靈敏度：
低可檢測人 IL-6 濃度達 4pg/ml,，
20 個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差,，計算相應(yīng)的可檢測濃度。

3. 特異性：
不與人 IL-6 sR,、IL-9,、IL-10 反應(yīng)，小鼠 IL-6,、IL-10,、IL-11、IL-12 等反應(yīng)。

4. 重復(fù)性：
板內(nèi),，板間變異系數(shù)<10%,。

5. 回收率：
在選取的健康人血漿、細胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的人 IL-6,，計算回收率。

6. 線性稀釋：

分別在選取的 4 份健康人血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人 IL-6,，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進行稀 釋,，評估線性。

 

參考文獻：
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《Some cardiac marker levels and cytokines in diabetic patients》 作者:Esmail S. Kakey and Shahen S. Hussen 期刊:International Conference on Pure and Applied Sciences 影響因子: PMID:
《Effect of blood purification on serum miR-126 and VEGF levels in the process of atherosclerosis in uremic patients under maintenance hemodialysis》 作者:Dong Zhao,Hong Shao 期刊:The Kaohsiung Journal of Medical Sciences 影響因子:1.291 PMID:30041762
《Release of mitochondrial DNA correlates with peak inflammatory cytokines in patients with acute myocardial infarction.》 作者:Chaoyi Qin, Jun Gu, Ruiqi Liu, Fei Xu , Hong Qian, Qian He, Wei Meng 期刊:Anatol J Cardiol 影響因子:1.112 PMID:27721319

Human IL-6 ELISA試劑盒