PCR常見問題分析與對策

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1.PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間
　　一般為48h以內(nèi),，有些好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失,。 

2.假陰性,，不出現(xiàn)擴增條帶
　　PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性,，③酶的質(zhì)量及,， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究,。
　　模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì),，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈,，特別是染色體中的組蛋白,，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚,。⑤模 板核酸變性不*,。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶,，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病,，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,，其程序亦應 固定不宜隨意更改。
　　酶失活：需更換新酶,，或新舊兩種酶同時使用,，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠,。
　　引物：引物質(zhì)量,、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,，是PCR失敗或擴增條帶不 理想,、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題,，兩條引物一條濃度 高,，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增,，對策為：①選定一個好的引物合成單 位,。②引物的濃度不僅要看OD值,，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有 引物條帶出現(xiàn),，而且兩引物帶的亮度應大體一致,，如一條引物有條帶，一條引物無條 帶,，此時做PCR有可能失敗,，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,，一條 亮度低,，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融 或長期放冰箱冷藏部分,，導致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理,，如引物長度不 夠,，引物之間形成二聚體等。
　　Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性,，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
　　反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul,、30ul,、50ul?；?00ul,，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,，在做小體積如20ul 后,，再做大體積時，一定要模索條件,，否則容易失敗,。
　　物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低,，變性時間短,，極有可能出 現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率,。有時還有必要用標準的溫度計,，檢測一下 擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,，這也是PCR失敗的原因之一,。
　　靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列,，其PCR擴增是不會成功的,。

3.假陽性
　　出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊,，亮度更高,。
　　引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增 時,，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列,。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽 性,。需重新設(shè)計引物,。
　　靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交 叉污染，導致假陽性,。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔,，防止 將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或 器材均應高壓消毒,。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時,，在加標本 前,，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸,。二是空氣中的小片段核酸污 染,，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性,。可互相拼接,，與引物互補后,，可擴 增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生,，可用巢式PCR方法來減輕或消除,。

4.出現(xiàn)非特異性擴增帶
　　PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小,，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不*互補,、 或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān),。其次是酶的質(zhì)和量,，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增,。其對策有：①必要時重新設(shè)計引 物,。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量,，適當增加模板量,，減少循環(huán)次 數(shù)。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,，65℃左右退火與延伸),。

5.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
　　PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差,，dNTP濃度過高,，Mg2+濃度過高，退火溫度過低,，循環(huán)次數(shù)過多引起,。其對策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶,。②減少dNTP的濃度,。③適當降低Mg2+濃 度。④增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù),。