用4℃預(yù)冷的1×PBS（pH7.2-7.4,，0.01M,，cell culture，貨號(hào)：P1020）沖洗組織,，去除殘留血液,，并去除組織上的筋膜,、脂肪等冗余組織,；

稱重后將組織用眼科剪刀和鑷子剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:5-1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)5-9 mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，在冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,，不建議反復(fù)凍融超過(guò)2次。因?yàn)檫^(guò)多的反復(fù)凍融可能影響細(xì)胞因子含量的穩(wěn)定性,。最后,，將組織勻漿液于2-8℃，5000×g離心5-10分鐘,，取上清檢測(cè),；

處理樣本的過(guò)程就是收集細(xì)胞因子或目標(biāo)蛋白的過(guò)程，由于細(xì)胞因子或蛋白結(jié)構(gòu)容易改變和降解,，組織勻漿過(guò)程完成后,，儲(chǔ)存也非常重要，特別需要注意的是,，不要反復(fù)凍融,，樣本處理之后可分裝密封保存，4度保存應(yīng)小于1周,，-20 度不應(yīng)超過(guò)3個(gè)月,，-80度不應(yīng)超過(guò)6個(gè)月。在標(biāo)本使用前應(yīng)室溫緩慢均衡溶化,，不能進(jìn)行加熱,。

超聲組織勻漿液的制備方法

提前將剪刀,、鑷子用75%酒精消毒，然后用預(yù)冷的1×PBS滌浸泡,，用來(lái)剪切,、剪碎組織；

對(duì)應(yīng)將要提取蛋白的組織編號(hào),，然后給EP管編號(hào),，放在冰上進(jìn)行預(yù)冷。用預(yù)冷的PBS （0.01M,，pH=7.4）沖洗組織,，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎,；

配置裂解液：提前將蛋白酶抑制劑（貨號(hào)：P6730）,、磷酸酶抑制劑（貨號(hào)：P1260）、PMSF（貨號(hào)：P0100）分別按照1:100的體積比加入到RIRP裂解液中,，快速搖勻后靜置冰上即可,；

將剪碎的組織，加入對(duì)應(yīng)體積的裂解液（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的裂解液,，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄）,；

在冰上,，用剪刀將組織剪碎（剪至組織顆粒非常細(xì)小，甚至剪成糜狀物）,，然后去超聲破碎即可,。（超聲的條件：儀器：新芝 Scientz-IID；破碎條件：180W超聲3s關(guān)6s,，超聲一次時(shí)間1min,，超聲3-4次）；

超聲破碎完成后,，離心（4℃,，12000rpm離心30分鐘）；

離心完成后,，用移液器吸取上清液至新的EP管中,，同時(shí)記錄蛋白提取液的體積，然后用BCA法測(cè)上清蛋白的濃度,。

組織勻漿液的蛋白定量必要性

為了避免假陽(yáng)性的產(chǎn)生

ELISA檢測(cè)指標(biāo)眾多,，某些組織樣本如肝臟，腎臟，腦組織等,，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)含有的蛋白復(fù)雜多變,，可能會(huì)造成與檢測(cè)指標(biāo)有假陽(yáng)性反應(yīng)。所以通過(guò)蛋白含量檢測(cè),，把高濃度（20mg/mL以上）的樣本進(jìn)行稀釋至1-2mg/mL,，進(jìn)行判斷是否存在假陽(yáng)性的可能；

為了方便后續(xù)的數(shù)據(jù)處理和比較分析

因?yàn)榻M織塊的大小,、提取蛋白的效率不同,，所以必然提取的組織勻漿液中蛋白含量在一定的范圍內(nèi)變化，或者樣本間蛋白含量差異顯著,。這些都會(huì)造成后續(xù)數(shù)據(jù)處理的困難,，無(wú)法分辨是因?yàn)檠芯刻幚淼挠绊懀€是蛋白含量造成的差異性,。因此,，大多數(shù)學(xué)者會(huì)繼續(xù)發(fā)掘數(shù)據(jù)的其余方面，例如,，處理組與對(duì)照組的含量百分比,；每克組織勻漿蛋白中細(xì)胞因子含量的比較,；聯(lián)用其余指示性指標(biāo)進(jìn)行比較,，例如，炎癥反應(yīng)級(jí)別,、脂肪率,、模型差異等進(jìn)行聯(lián)合比較分析。

組織勻漿液進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)的思考

因?yàn)槟壳皺z測(cè)細(xì)胞因子的類型越來(lái)越多,，我們也要重新考慮樣本處理適合自己的樣本類型，并且適合自己檢測(cè)的細(xì)胞因子類型,，例如,，檢測(cè)因子有可能為蛋白酶3（Protease 3）、核糖核酸酶A（核糖核酸酶A）,、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE/ELA2）等具有酶活性質(zhì)的細(xì)胞因子,，在組織勻漿過(guò)程中是否添加蛋白酶抑制劑就值得思考；

一些檢測(cè)細(xì)胞因子需要酸化激活處理也需要特別注意,，例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）,、肌肉生長(zhǎng)抑制素（GDF-8）等，因此在組織勻漿液的pH最好處于6.5-7.5的中性范圍,；

以上我們介紹的方法只是比較通用的方法學(xué),。最后，我們作為科學(xué)研究使用，還是需要更多的參考具有代表性,、可靠文獻(xiàn)中所述的處理方法,，避免因?yàn)樽约簶颖咎幚淼姆绞讲粚?duì)，造成ELISA檢測(cè)的失敗,，影響檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和真實(shí)性,。