常規(guī)的抗生素是治療細菌感染*泛的手段,，然而多重耐藥性（MDR）正成為細菌感染臨床治療中的巨大挑戰(zhàn),，特別是對于慢性不愈合傷口感染而言，這增加了患者的發(fā)病率和死亡率,。近年來,，具有小尺寸和高比表面積的納米材料被廣泛用于抗細菌感染方面。由于納米材料的抗菌機制與傳統(tǒng)抗生素不同,，導致細菌耐藥的可能性較小,，可作為抗生素的替代品。銀納米顆粒（AgNPs）具有突出的廣譜抗菌性能和顯著的抑菌效果,，但AgNPs和釋放的Ag+在高濃度下均表現(xiàn)出嚴重的細胞毒性,；同時，AgNPs極易團聚會顯著降低其抗菌效率,，從而阻礙其實際應用,。為了解決這些問題,，構建具有良好分散能力的抗菌雜化材料成為一種新的發(fā)展趨勢。
光熱治療（PTT）具有空間分辨率高,、微創(chuàng),、組織穿透力強等優(yōu)勢，由于其*的抗菌機制,，產生耐藥性的可能性較小,。因此，抗菌劑與近紅外激光（NIR）聯(lián)合使用可能是一種更有前途的策略,，可以彌補PTT的局限性,，提高殺菌性能。到目前為止,，已有多種具有光熱效應的金屬材料用于細菌殺滅和傷口愈合研究,，其中，普魯士藍（PBNPs）具有在NIR吸收能力強,、光熱轉換性能高,、穩(wěn)定性好、生物相容性好,、生物安全性高,、成本低等突出優(yōu)勢。此外PBNPs也可直接錨定AgNPs,，從而有效避免AgNPs的聚集并控制Ag+的釋放,。
湖南大學生物學院劉斌副教授課題組構建了一種多功能的納米抗菌復合物PB@PDA@Ag用于治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染。聚多巴胺（PDA）被涂覆在PBNPs表面,，通過化學反應形成PB@PDA NPs,；然后通過原位還原在PDA表面直接合成AgNPs，形成PB@PDA@Ag,。在此過程中,，PDA作為還原劑和穩(wěn)定劑。此外,，PDA具有良好的光熱效應,，可提高其抗菌活性和生物相容性。在這項研究中,，作者通過PB@PDA@Ag的抗菌特性和NIR照射下的光熱效應,，證明了這種納米平臺在體外*多藥耐藥細菌的能力。更重要的是,，該聯(lián)合策略對MRSA感染的糖尿病創(chuàng)面具有顯著的治療效果,。
基本信息
題目：
PB@PDA@Ag nanosystem for synergistically eradicating MRSA and accelerating diabetic wound healing assisted with laser irradiation
期刊：Biomaterials
影響因子：10.317
PMID：32171103
通訊作者：王煒教授和劉斌副教授為并列通訊作者
作者單位：湖南大學；湖南中醫(yī)藥大學,；湖南師范大學
索萊寶合作產品：
產品名稱 | 產品貨號 |
Dopamine Hydrochloride 鹽酸多巴胺 | ID0370 |
摘 要
多重耐藥性細菌感染和慢性創(chuàng)面愈合正成為臨床治療中的巨大挑戰(zhàn),，迫切需要開發(fā)新型抗菌材料和治療策略,，尤其對于患有MDR感染的糖尿病患者。在這項工作中,，命名為PB@PDA@Ag的納米復合物被用于在NIR照射下協(xié)同*多藥耐藥細菌和加速耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染的糖尿病創(chuàng)傷模型的傷口愈合,。體外研究顯示：與單獨的PB@PDA@Ag或NIR激光照射相比，這種聯(lián)合抗菌策略通過破壞細胞完整性,、產生ROS,、降低ATP、氧化GSH等途徑發(fā)揮協(xié)同抗多藥耐藥菌MRSA作用,；體內實驗表明：該策略通過減輕局部炎癥反應和誘導創(chuàng)面血管內皮生長因子（VEGF）表達來促進MRSA感染的糖尿病創(chuàng)面愈合,。同時，該PB@PDA@Ag具有良好的生物相容性,，基本不會對重要器官造成額外的損害,。綜上所述，PB@PDA@Ag和NIR聯(lián)合抗菌策略在臨床感染領域具有巨大的應用前景,。
研究內容及結果
1,、PB@PDA@Ag的構建與表征
按照方案一將PB置于最里層，PDA包裹PB后充當納米Ag的載體構建PB@PDA@Ag,。TEM結果表明：PB NP平均尺寸約為88 nm,，PB@PDA的平均尺寸約為104 nm，表明PDA涂層的平均厚度約為8 nm（圖1A-B）,；AgNPs在PB@PDA表面上呈均勻分布（圖1C）,。PB NPs的zeta電位隨著PDA的包裹而降低，AgNPs（Ag+）的加入導致PB@PDA的zeta電位從-17mV增加到-12mV（圖1D）,。XRD表明：與PB@PDA相比,，特征衍射峰存在于38.3°，對應于金屬Ag的（111）面（圖1E）,。拉曼光譜檢測顯示（圖1F）：PB NP的拉曼峰位于2154 cm-1；PB@PDA和PB@PDA@Ag的拉曼峰在1402 cm-1和1578 cm-1處,。XPS表明：由于PDA層的存在,，PB@PDA和PB@PDA@Ag未觀察到明顯的Fe 2p峰（圖1G）。紫外可見吸收光譜檢測顯示（圖1H）：PB NPs在720 nm附近有強吸收峰,；PB@PDA的吸光度峰移至710 nm,；PB@PDA@Ag在440 nm附近有明顯吸收峰。FT-IR檢測顯示（圖1I）：PB NPs在2080 cm−1有特征峰,；加入PDA后,，在約3420 cm−1處出現(xiàn)了一個較寬較強的譜帶。以上結果表明PB@PDA@Ag的構建成功,。
圖1
2,、PB@PDA@Ag具有較高的光熱轉換效率和優(yōu)異的光穩(wěn)定性
為了證明PB@PDA@Ag NPs作為PTT的光熱劑的能力,，系統(tǒng)地比較了不同納米材料在NIR下的光熱效應。結果表明：在808 nm NIR照射8 min后,，PB,、PB@PDA及PB@PDA@Ag的溫度升高分別為31.9℃、33.2℃和30.9℃,，而純水的溫度僅升高1.7℃（圖2A）,；實時光熱圖像直接顯示了它們的光熱效應（圖2B）。PB@PDA@Ag具有激光密度依賴性和濃度依賴性的光熱轉換（圖2C-D）,。PB@PDA@Ag的光熱轉換效率為30.35%（圖2E）,。在1 W/cm2的激光照射5個循環(huán)后，PB@PDA@Ag吸收沒有降低,，并維持恒定的光熱轉換效率,，表現(xiàn)出較高的光穩(wěn)定性（圖2F）。因此,，PB@PDA@Ag是一種很有前途的PTT試劑,。
圖2
3、PB@PDA@Ag+NIR具有更強的體外抗菌活性
采用瓊脂擴散法和NIR評價不同納米材料的抗菌能力,。相對于其他實驗組,，PB@PDA@Ag處理組所有受試菌的抑菌圈都清晰可見（圖3A）；金黃色葡萄球菌,、MRSA,、大腸桿菌和AmprE的抑菌圈直徑分別約為14毫米、14毫米,、16毫米和21毫米（圖3B）,；表明PB@PDA@Ag對革蘭氏陰性菌E.coli和AmprE.coli的抑制作用更強（圖3C）。PB+NIR處理組MRSA和AmprE.coli存活率分別為33.0%和25.8%,；PB@PDA@Ag處理組的存活率分別為33.3%和25.4%（圖3D-E）,；PB@PDA@Ag+NIR處理組中，分別約99.77% MRSA和99.99% AmprE被殺死（圖3F-I）,。
圖3
通過Calcein-AM/PI實驗分析不同處理組細菌的膜完整性,。生理鹽水、NIR,、PB和PB@PDA處理組中僅觀察到強烈的綠色熒光,；PB+NIR、PB@PDA+NIR和PB@PDA@Ag處理組同時觀察到綠色和紅色熒光,；PB@PDA@Ag+NIR處理組觀察到強烈的紅色熒光和極弱的綠色熒光（圖4A）,。使用ImageJ軟件定量分析表明：與其他組相比，PB@PDA@Ag+NIR的抗菌功效最高（圖4B）。SEM圖像表明在用生理鹽水,、NIR,、PB或PB@PDA處理后，MRSA具有完整且光滑的表面,；PB+NIR,、PB@PDA+NIR或PB@PDA@Ag處理后，細胞表面出現(xiàn)明顯的下垂和收縮（紅色箭頭所示）等破壞,；而用PB@PDA@Ag+NIR處理后,，細菌的結構*被破壞（圖4C）。
圖4
4,、PB@PDA@Ag的抗菌機理
監(jiān)測ROS水平,，發(fā)現(xiàn)相較于其他處理組，PB@PDA@Ag+NIR處理組的ROS水平顯著上調（圖5A-B）,。Ellman測定表明,，PB@PDA@Ag和PB@PDA@Ag+NIR的GSH氧化水平分別高達45.8%和58.7%（圖5C）。檢測細菌內ATP水平的變化發(fā)現(xiàn)：PB+NIR,、PB@PDA+NIR,、PB@PDA@Ag和PB@PDA@Ag+NIR處理組分別導致細菌ATP水平下降約47.8%、53.1%,、77.8%和96.7%（圖5D）,。這些結果表明：PB@PDA@Ag+NIR的抗菌作用是通過誘導ROS產生、氧化GSH和降低ATP等途徑進行的,。同時,，與對照組相比，PB@PDA@Ag+NIR處理的細菌蛋白質滲漏增加了1.9倍（圖5E）,，表明PB@PDA@Ag+NIR對細菌細胞膜造成了嚴重破壞,。
圖5
5、PB@PDA@Ag+NIR對MRSA生物膜損傷最大
持續(xù)性細菌感染與生物膜的形成密切相關,，生物膜可以抑制抗生素的滲透,，逃避宿主吞噬細胞的先天免疫攻擊。作者檢測了不同處理對MRSA形成的生物膜的影響（圖6A-C）：與對照組相比,，單獨的NIR,、PB和PB@PDA處理對MRSA生物膜的影響可以忽略不計；PB@PDA@Ag,、PB+NIR和PB@PDA+NIR處理后，可以去除約51%~52%生物膜,；PB@PDA@Ag+NIR處理后,，可去除約76%生物膜。
圖6
6,、PB@PDA@Ag+NIR對體內傷口的愈合效果好
將MRSA感染傷口的雌性Balb/c小鼠隨機分為八組（圖7A）,，NIR照射5分鐘后,，用PB、PB@PDA或PB@PDA@Ag處理的傷口區(qū)域的溫度增加到約53°C,；PBS+NIR處理的傷口區(qū)域僅升高1.2°C（圖7B）,。圖7C為在不同時間點進行各種處理的傷口閉合的代表性照片。治療8天后,，PBS,、NIR、PB,、PB+NIR,、PB@PDA、PB@PDA+NIR,、PB@PDA@Ag和PB@PDA@Ag+NIR組感染創(chuàng)面面積分別減少至58.79%,、59.24%、56.81%,、47.90%,、51.46%、41.77%,、41.88%和22.79%（圖7D）,。此外，在所有組中均未觀察到體重的顯著波動（圖7E）,，表明這些測試的納米材料對小鼠具有良好的生物安全性,。
通過H&E染色進行炎癥分析，相較于其他實驗組,，PB@PDA@Ag+NIR處理后,，傷口上的炎癥細胞數量顯著減少。此外,，在PB@PDA@Ag+NIR組中可以清楚地觀察到完整的表皮層（由紅色箭頭表示）,；對于其他組，不完整的表皮層伴有明顯的組織損傷（圖7F）,。
圖7
7,、PB@PDA@Ag+NIR有效促進體內MRSA感染的糖尿病傷口愈合
通過MKR轉基因糖尿病小鼠模擬臨床傷口模型，對MRSA感染的糖尿病傷口模型的體內抗感染功效進行評估（圖8A）,。不同給藥方式處理后,，在第12天，PB@PDA@Ag+NIR處理組的創(chuàng)面幾乎*愈合（圖8B-C）,。與空白對照組相比,，PB@PDA@Ag+NIR給藥組小鼠的體重變化可以忽略不計（圖8D），這證實了PB@PDA@Ag+NIR對小鼠的低毒性。通過比較感染區(qū)域的細菌CFU顯示,，PB@PDA@Ag+NIR的殺菌效果最高（圖8E-F）,。免疫熒光染色顯示，與其他組相比,，PB@PDA@Ag+NIR處理組的感染創(chuàng)面VEGF表達水平最高（圖8G-H）,。
綜上所述，我們推測PB@PDA@Ag+NIR促進傷口慢性愈合的機制可能與以下原因有關：（1）PB@PDA@Ag光熱效應產生局部熱療,，釋放Ag+,，消除感染創(chuàng)面大部分細菌；（2）PB@PDA@Ag+NIR給藥后可顯著降低創(chuàng)面的炎癥反應,；（3）VEGF顯著上調可增加創(chuàng)面組織中新生血管的形成,。在新生血管的幫助下，促進參與創(chuàng)面愈合的細胞代謝和增殖,，促進再上皮化,，實現(xiàn)創(chuàng)面高效愈合。
圖8
8,、生物安全性評估
對血清進行腎功能和肝功能分析,，未發(fā)現(xiàn)PB@PDA@Ag對機體有任何毒性（圖9A-B）。H&E染色顯示：PB@PDA@Ag+NIR治療期間未對各器官的正常解剖結構造成損傷或毒性（圖9C）,。這些結果證明了PB@PDA@Ag可以有效,、安全的*MDR細菌引起的慢性傷口感染。
圖9
結 論
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