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1.CA4-FeAlg/HCQ納米顆粒的制備與表征

CA4-FeAlg/HCQ的制備過程如圖1A所示,。按圖2A步驟合成Alg-CA4偶聯(lián)物,，圖2B表明CA4成功連接到Alg分子上。CA4是通過新的酯鍵合成,，成功接至Alg骨架上（圖2C）,。制備的Alg-CA4可通過核磁共振氫譜進一步研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)（圖2D）。TEM直觀顯示CA4-FeAlg納米凝膠的形態(tài)為類球形,，尺寸分布相對均勻（圖2E,、F）。CA4-FeAlg平均水合粒徑約為150nm（圖2G）,。以Fe³⁺為交聯(lián)劑合成的CA4-FeAlg平均電位值從-21.9mV變?yōu)?.23mV（圖2H）,。

選擇自噬抑制劑HCQ作為聯(lián)用藥物協(xié)同治療腫瘤。將CA4-FeAlg凍干粉在HCQ溶液中緩慢溶脹,，更多的HCQ分子隨著水分子進入納米凝膠網(wǎng)絡(luò)中,。如圖2I所示,，投藥比為1:2是優(yōu)制備條件。CA4-FeAlg/HCQ納米凝膠的粒徑分布范圍依然較窄,，終水合粒徑為165nm（圖2J）,。在進一步載藥后，CA4-FeAlg/HCQ的平均電位值也由9.23mV變?yōu)?13.1mV（圖3A）,。

2.藥物釋放能力的評估

研究者采用pH7.4+10%BSA溶液模擬血液生理環(huán)境,。在這種介質(zhì)溶液中，48h內(nèi)只有17%的CA4從CA4-FeAlg中釋放出來（圖3B）,。此外由釋放曲線可知,，CA4的釋放具有pH依賴性（圖3B）。與在pH5.5介質(zhì)溶液中相比,，置于pH7.4介質(zhì)溶液中（模擬腫瘤血管環(huán)境）的CA4釋放速率更快,，其累積釋藥百分率在12h內(nèi)甚至達到92.12%（圖3C）。CA4釋放后的納米凝膠仍保留原始結(jié)構(gòu)（圖3D）,，與直接合成的FeAlg結(jié)構(gòu)并無明顯差異（圖3E）,。這一結(jié)果說明，CA4-FeAlg納米凝膠在血液循環(huán)過程中可以穩(wěn)定存在,，而在腫瘤血管處CA4可以快速釋放出來,。

接下來，用同樣的方法評估了HCQ在CA4-FeAlg/HCQ體系中的釋放特性（圖3F）,。從圖3F可以看出,，HCQ在有GSH存在的介質(zhì)中釋放速度明顯加快。這一現(xiàn)象歸因于在GSH的還原條件下,，納米凝膠中的Fe³⁺被還原為Fe²⁺,，F(xiàn)e²⁺與Alg的親和作用降低，納米凝膠自外而內(nèi)進行解離,，從而實現(xiàn)HCQ的有效釋放,。在弱酸性環(huán)境中（pH5.5+5mM GSH，模擬腫瘤細胞）這種現(xiàn)象表現(xiàn)更明顯,，24h時HCQ的累積釋藥率可達到95.07%,，而pH7.4+10%BSA介質(zhì)中HCQ釋放較慢。以上結(jié)果表明,，CA4-FeAlg/HCQ遞藥體系在血液和正常組織中能夠保持相對穩(wěn)定,，而蓄積到腫瘤部位后CA4和HCQ可在各個靶向位點連續(xù)釋放。

3.細胞攝取和溶酶體共定位

如圖4A所示,，F(xiàn)eAlg納米凝膠可被A549細胞高效攝取,，實現(xiàn)藥物的有效遞送。為了進一步探索FeAlg在細胞內(nèi)的分布,，利用LSCM對納米凝膠與細胞器的共定位現(xiàn)象進行了可視化研究,。如圖4B所示,，由于游離FITC無法進入A549細胞，視野中未發(fā)現(xiàn)綠色熒光,，F(xiàn)eAlg/FITC組在共孵育0.5h時,，胞質(zhì)內(nèi)首先觀測到微弱的綠色熒光，熒光灰度值顯示FeAlg與溶酶體的平均共定位系數(shù)為0.15±0.03,。隨著培養(yǎng)時間的推移,，細胞中的綠色熒光也在一直不斷增多并且逐漸聚集于溶酶體，在1h和3h時,，平均共定位系數(shù)分別增加到0.49±0.07和0.74±0.09,。以上結(jié)果顯示溶酶體可能成為FeAlg/HCQ納米凝膠遞藥系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用的有效靶點。

4.溶酶體損傷與自噬抑制

當納米凝膠被腫瘤細胞攝取并蓄積在溶酶體內(nèi)后,，F(xiàn)e³⁺在高GSH作用下轉(zhuǎn)化為Fe²⁺,，在這種特殊的微環(huán)境中Fe²⁺又可與瘤內(nèi)H₂O₂引起“芬頓”反應(yīng)生成•OH（圖5A），導(dǎo)致溶酶體破裂,，從而使自噬溶酶體的形成及降解受到嚴重阻礙,。藥物處理6h后，細胞內(nèi)pH變化趨勢如圖5B所示,。與空白組相比，HCQ和CA4-FeAlg/HCQ組的熒光信號明顯增強,，表明細胞內(nèi)pH值顯著升高,。

為了研究•OH和pH值變化對溶酶體穩(wěn)定性的影響，用LSCM記錄溶酶體的變化情況,。如圖5C和圖5D所示,，空白對照組中所有細胞的溶酶體形態(tài)完整，聯(lián)合•OH和pH升高對溶酶體的破壞效應(yīng),，CA4-FeAlg/HCQ處理組中平均熒光密度驟降至25.44,，僅為對照組的2.28%。由此表明,，F(xiàn)eAlg和HCQ可以共同作用于溶酶體,。

接下來，作者研究了CA4-FeAlg/HCQ在缺乏營養(yǎng)時,，對腫瘤細胞自噬水平的影響,。圖5E顯示，與DMEM組相比,，在EBSS組中出現(xiàn)了顯著的LC3蛋白的陽性自噬體,。HCQ和CA4-FeAlg/HCQ處理后，細胞內(nèi)的LC3蛋白表達均顯著增加,。這是因為營養(yǎng)缺乏誘導(dǎo)細胞自噬后,，•OH引起的溶酶體膜的不穩(wěn)定和HCQ引起的溶酶體酸性環(huán)境的破壞可以協(xié)同抑制自噬小體的降解,，導(dǎo)致大量自噬體的積累。LC3-II:LC3-I值也為證明CA4-FeAlg/HCQ通過抑制自噬引起自噬體累積提供了依據(jù),。以上結(jié)果表明,，CA4-FeAlg/HCQ在無營養(yǎng)情況下能有效抑制腫瘤細胞自噬。

5.體外腫瘤深部滲透與細胞毒性

通過體外模擬TME,，研究CA4-FeAlg納米凝膠的形態(tài)變化,。在pH6.5，20μM GSH的介質(zhì)中,，CA4-FeAlg已經(jīng)明顯解體為小納米凝膠,，水合粒徑減小為27nm左右（圖6A）。而當酸性變強,，GSH濃度增加后,，CA4-FeAlg納米凝膠自外向內(nèi)解離，發(fā)生了相重構(gòu),，大多數(shù)納米凝膠的粒徑變得更小甚至溶解（圖6B）,。這是因為FeAlg納米凝膠的交聯(lián)劑Fe³⁺可以被GSH迅速還原為Fe²⁺。Fe²⁺與Alg的相互作用較弱導(dǎo)致FeAlg結(jié)構(gòu)從外向內(nèi)解離,。

研究者利用3DMCS模型考察體外深部滲透效果,。如圖6C表明SiO₂納米粒子很難擴散到腫瘤深部。而在80μm深度時,，F(xiàn)eAlg/FITC組中有強烈的綠色熒光分布在腫瘤球的中央?yún)^(qū)域,。120μm深度時，F(xiàn)eAlg/FITC+10mM GSH組中有更多的綠色熒光分布于腫瘤球的中央范圍內(nèi),，其相對熒光強度是SiO₂/FITC組的12倍,。圖6D顯示，F(xiàn)eAlg/FITC+10mM GSH組的相對熒光強度均高于其他兩組,。以上結(jié)果表明FeAlg納米凝膠分裂成小的納米顆粒后,，利于實現(xiàn)腫瘤的深部滲透。

CA4-FeAlg和CA4-FeAlg/HCQ的細胞毒性明顯集中,，呈一定的時間依賴性（圖6E和F）,。選擇CA4前藥CA4P作為陽性對照組。CA4-FeAlg組的細胞抑制率均明顯高于CA4P組,，表明CA4-FeAlg納米凝膠可作為CA4前藥用于腫瘤治療,。此外，如圖6F所示,，CA4-FeAlg/HCQ對A549細胞的毒性強,。當藥物濃度為20μg/mL，作用時間為48h時，CA4-FeAlg/HCQ組的細胞抑制率甚至達到93.86±4.78%,。此外,，觀察CA4-FeAlg/HCQ組的活細胞數(shù)（綠色）少（圖6G）?；谝陨辖Y(jié)果,，CA4-FeAlg/HCQ可在體外有效殺傷A549腫瘤細胞。

6.體內(nèi)腫瘤的靶向性與穿透性

如圖7A所示,，游離的IR783廣泛分布于裸鼠體內(nèi),，并在體內(nèi)被迅速清除。隨著時間的延長,，腫瘤內(nèi)的熒光信號大幅度減弱,。而FeAlg/IR783和CA4-FeAlg/IR783組腫瘤區(qū)域的熒光信號都在逐漸增加，在8h時達到高,。隨后,，F(xiàn)eAlg/IR783組腫瘤內(nèi)的熒光強度迅速下降，24h時僅存在微弱熒光,。然而,，CA4-FeAlg/IR783在24h仍有較強的熒光。體外成像結(jié)果（圖7B）顯示游離IR783主要在肝,、腎組織內(nèi)分布,，F(xiàn)eAlg/IR783主要存在于肝組織，腎,、肺和腫瘤組織中也有少量分布,。CA4-FeAlg/IR783主要存在于腫瘤組織，這歸因于CA4與β-微管蛋白上的秋水仙堿受體結(jié)合,。以上結(jié)果進一步證明CA4-FeAlg/IR783具有優(yōu)異的腫瘤靶向性,，有助于藥物在腫瘤部位大量蓄積,。

作者研究了CA4-FeAlg/HCQ在腫瘤組織內(nèi)的深部穿透性能,。如圖7C和7D所示，粒徑穩(wěn)定的SiO₂/FITC腫瘤組織穿透性較差,，主要分布在腫瘤血管周圍,。然而，F(xiàn)eAlg/FITC組中的穿透距離顯著增大,。上述結(jié)果均表明CA4-FeAlg可以將治療藥物高效遞送至腫瘤部位,，并均勻滲透到實體瘤組織中。

7.體內(nèi)抗腫瘤效果和安全性評價

為了系統(tǒng)性評價CA4-FeAlg/HCQ的抗癌性能,，作者研究了CA4-FeAlg/HCQ在A549荷瘤裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用,。如圖7E所示，N.S.組的相對腫瘤體積一直在升高，終達到1.96±0.17,。CA4P對腫瘤生長有一定程度的抑制作用,，但腫瘤體積波動較大。相比之下,，CA4-FeAlg能夠顯著抑制A549腫瘤的生長,，揭示CA4-FeAlg作為新型的CA4前藥具有良好的抗腫瘤效果。CA4-FeAlg/HCQ的治療效果佳,，治療終點時的腫瘤體積?。▓D7F）。CA4-FeAlg/HCQ的佳抗腫瘤作用可能來源于以下三個機制：其一,，CA4破壞腫瘤血管系統(tǒng)切斷外源性營養(yǎng)供應(yīng),，腫瘤細胞發(fā)生壞死；其二,，F(xiàn)eAlg通過響應(yīng)TEM生成ROS產(chǎn)生細胞毒性,；其三，CA4誘導(dǎo)的自噬被HCQ抑制,，阻斷腫瘤細胞的內(nèi)源性營養(yǎng)通道,。接下來，研究者逐一驗證了這些可能的機制,。

如圖8A所示,，N.S.組中的腫瘤血管相對完整、豐富,。然而,，CA4P組中的腫瘤血管密度明顯降低。在CA4-FeAlg組,，腫瘤血管數(shù)量少,，細胞之間的空隙也變大。接下來,，作者對腫瘤細胞內(nèi)的•OH含量進行了測定,。實驗結(jié)果表明（圖8B），F(xiàn)eAlg給藥組的腫瘤細胞中•OH含量明顯增加,，熒光強度是N.S.組的3.58倍,。由此表明，F(xiàn)eAlg在腫瘤細胞中可以通過芬頓反應(yīng)高效快速的產(chǎn)生大量•OH,。研究者采用免疫組化與TEM表征對CA4-FeAlg/HCQ抑制腫瘤細胞自噬的情況進行考察,。如圖8C所示，與N.S.和CA4-FeAlg組相比,，HCQ和CA4-FeAlg/HCQ組自噬相關(guān)蛋白LC3表達明顯升高,，其中以CA4-FeAlg/HCQ組表達水平高,。此外，TEM結(jié)果（圖8D）也證明,，經(jīng)CA4-FeAlg/HCQ處理后的腫瘤細胞中顯著存在大量累積的自噬泡（黃色箭頭指示）,。這再次提示CA4-FeAlg抗血管治療誘導(dǎo)的自噬可被HCQ有效抑制，從而實現(xiàn)抗血管與自噬抑制協(xié)同治療腫瘤的目的,。

研究者記錄了治療期間荷瘤小鼠的體重,。如圖8E所示，各組之間的荷瘤鼠體重沒有發(fā)生急劇下降的現(xiàn)象,，治療期間的變化趨勢基本相同,，沒有顯著性差異，說明CA4-FeAlg/HCQ納米凝膠相對安全,，毒副作用較小,。各組心、肝,、脾,、肺、腎,、腦組織均無明顯病理改變,，進一步證明了CA4-FeAlg/HCQ的生物安全性。