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南京科佰生物科技有限公司
主營產(chǎn)品： atcc代理,ATCC細胞系,ATCC細胞株,ATCC細胞庫購買 |
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2025-4-27 閱讀(91)
描述
數(shù)字PCR（DPCR）是一種核酸定量技術(shù)，能夠在單分子水平上對DNA或RNA進行絕對定量,。與傳統(tǒng)的實時熒光定量PCR（qPCR）相比,，DPCR具有更高的靈敏度和準確性，因此在生物學研究和臨床診斷中得到了廣泛應用,。
DPCR腫瘤領(lǐng)域相關(guān)應用
DPCR腫瘤領(lǐng)域相關(guān)應用：
檢測Gene Expression,，主要是檢測mRNA的定量分析;
檢測Mutation（SNV和Indel），可以檢測拷貝數(shù),，也可以檢測比率,；
檢測CNV（拷貝數(shù)變異分析），相對定量,；
檢測Fusion,，可以檢測拷貝數(shù)，也可以檢測比率,；
科佰生物
科佰生物針對以上應用開發(fā)對應的檢測試劑盒,，配套科佰生物的參考品，對試劑盒做性能評價,，如下我們以EGFR T790M為例：
實驗一：LOB空白限測試
待測樣本：20個陰性樣本和1個NTC,。分別將投入量設(shè)置為10ng和40ng,，每個樣本做兩個重復進行Bio-Rad數(shù)字PCR檢測,。
由上數(shù)據(jù)可見：無論是10ng還是40ng，LOB控制在2拷貝以內(nèi)（一般噪音拷貝為5以內(nèi)）,，雜點不呈現(xiàn)劑量的依賴,，是隨機產(chǎn)生的噪音信號。
實驗二：準確性測試
待測樣本：10個NGS驗證為陽性的樣本（編號1-10）; 10個NGS驗證為陰性的樣本（編號11-20）,。對20個樣本分別使用數(shù)字PCR檢測,。
由上數(shù)據(jù)可見：
①測試10個NGS陽性樣本,檢測結(jié)果均為陽性，陽性符合率100%,，并定量檢出變異頻率,。
②測試10個NGS陰性樣本,檢測結(jié)果均為陰性，陰性符合率100%,，定值變異頻率均為0%,。
實驗三：線性范圍測試
1、投入量與拷貝數(shù),、頻率之間的線性測試
首先選取50%突變頻率的EGFR T790M標準品(CBP10402),，該標準品是通過基因編輯，二等位基因,，CN=2,，編輯一條為mutation，一條為WT,，經(jīng)過理論值計算,、Sanger測序,、Bio-Rad DdPCR試劑盒（Assay ID: dHsaCP2000019）共同驗證，確認為50%的頻率,。
1.1 投入量在0.1ng~200ng間設(shè)置10個梯度,，進行數(shù)字PCR檢測（2復孔），分別考量FAM拷貝數(shù)與投入量是否線性相關(guān),、VIC拷貝數(shù)與投入量是否線性相關(guān),；
1.2 投入量在0.1ng~200ng間設(shè)置10個梯度，進行數(shù)字PCR檢測（2復孔）,，判斷是否滿足%AF=50±10%波動,。
由上數(shù)據(jù)可見：
①200 ng投入量過大，拷貝數(shù)不呈現(xiàn)線性,，雖然滿足45-55%范圍,，但是不適合做單一通道的拷貝數(shù)判定；
②0.1 ng投入量過小,，拷貝數(shù)不呈現(xiàn)線性,，同時42.59%也低于45%，不適合做單一通道,，也不適合做雙通道,；
因此：范圍為0.5-100ng。
2,、線性稀釋不同頻率理論值與檢測值的線性測試
根據(jù)以上結(jié)論,，我們選取10ng作為進一步的%AF線性范圍探索，首先使用EGFR T790M的對應的陰性標準品,，對50%的標準品進行有限稀釋,，0.1%-50%間設(shè)置9個AF梯度，進行數(shù)字PCR檢測（2復孔）,。
由上數(shù)據(jù)可見：在10ng的投入量下,，AF%呈現(xiàn)非常好的線性稀釋，存在波動,，但是都在誤差范圍內(nèi),。
實驗四：檢測限測試
我們可以通過理論計算來預測下可能的檢測限范圍。當控制拷貝在15000（對應50ng input）以內(nèi)時LOB數(shù)據(jù)是2,，2/15000=0.0133%,，預測檢測限為0.0200%。
在如此低頻的情況下,，臨床適用場景適合ctDNA,，一般來說臨床上10ml全血，一般中位值ctDNA是20-40ng,，取低值20ng,。20ng 理論值6000個拷貝數(shù),，2/6000=0.0333%，預測檢測限為0.0500%,。
0.05%的誤差范圍是±50%,，就是0.025-0.075%，因此我們選擇3個點,，探尋LOD分別為 0.010%,、0.050%、0.100%,，要求95%檢出,。
0.010%
對20個0.01%的樣本進行數(shù)字PCR檢測，觀察在0.005-0.015%以內(nèi)是否達成95%檢出,。
0.05%
對20個0.05%的樣本進行數(shù)字PCR檢測,，觀察在0.025-0.075%以內(nèi)是否達成95%檢出。
0.1%
對20個0.1%的樣本進行數(shù)字PCR檢測,，觀察在0.05-0.15%以內(nèi)是否達成95%檢出,。
由上數(shù)據(jù)可見：選擇0.05%作為該檢測試劑盒的檢測限LOD。
實驗五：精密度測試
選取強陽性2%樣本20個,，中陽性1%樣本20個,，弱陽性0.2%樣本20個分別進行數(shù)字PCR檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：強陽性2% ,、中陽性1% ,、弱陽性0.2%三種檢測體系下,，誤差均在合理的范圍內(nèi),，精密度良好。
實驗六：回收率測試
首先使用EGFR T790M的對應的陰性標準品,，對50%的標準品進行有限稀釋,，每個梯度使用陰性樣本兩倍稀釋，接著對11個樣本進行檢測,。
由上數(shù)據(jù)可見：當AF在0.05%-50%范圍內(nèi),，對應的回收率在80-120%范圍，符合預期,。
實驗七：重復性測試
取10個不同AF（1%~50%）的標準品樣本,，分別安排實驗員A、實驗員B在同一天,，每人進行四次檢測,。
由上數(shù)據(jù)可見：EGFR T790M檢測體系是穩(wěn)定可重復的檢出的。
實驗八：重現(xiàn)性測試
取10個不同AF（1%~50%）的標準品樣本,，分別安排①實驗員A,、實驗員B在同一天進行每人四次實驗測試,；②實驗員A在第一天、第二天分別進行四次實驗測試,；③實驗員A在第一天進行四次實驗測試,，實驗員B在第二天進行四次實驗測試。
由上數(shù)據(jù)可見：EGFR T790M檢測體系是穩(wěn)定可重復的在不同人,、不同時間檢出,，重現(xiàn)的。
科佰生物已經(jīng)開發(fā)了多款dPCR試劑盒檢測體系,，并利用自身的標準品進行了性能驗證,。可用于基因突變,，融合,，拷貝數(shù)變異等的檢測。同時,，我們可以提供dPCR檢測的科研服務,，基于其絕對定值、精準定量的強大優(yōu)勢,，為客戶的樣本檢測提供優(yōu)質(zhì)服務,。
