關(guān)鍵詞:基于慢病毒載體的miRNA載體構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌基于慢病毒載體的miRNA載體構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)原裝，質(zhì)量保證,*,。
基于慢病毒載體的miRNA載體構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系,。
我們具備豐富的蛋白表達設(shè)計經(jīng)驗及實驗操作技巧，承諾客戶不成功不收費,。我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復(fù)我們的實驗結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌：   
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>慢病毒載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染,、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息,。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白,。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒,，需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞,，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中,，離心取得上清液后,，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后,，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄,，整合到基因組，從而高水平的表達效應(yīng)分子,。
miRNA是一種21－25nt長的單鏈小分子RNA, 是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成,，miRNA具有高度的保守性、時序性和組織特異性.而且這種特異性和時序性,，決定了組織和細胞的功能特異性,，表明miRNA在細胞生長和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過程中起多種作用，因此miRNA的研究受到了生物學(xué)家的廣泛關(guān)注,。 
本中心可以將客戶研究的miRNA構(gòu)建到慢病毒載體,，生產(chǎn)的病毒顆粒可以直接用于感染細胞或者動物實驗,?？梢赃x擇將Pri-miRNA或者PremiRNA構(gòu)建到載體，構(gòu)建中也可以根據(jù)實驗需要選用不同的Flank.
特點：
1．可以穩(wěn)定長期的表達miRNA，可以用于篩選穩(wěn)定細胞模型用于長期的研究和觀察,。 
2．感染效率高而且可以感染絕大部分細胞種類。 
3．可以直接用于動物實驗或者感染細胞后回輸?shù)絼游矬w內(nèi),。
1.將actin基因,，放入慢病毒融合表達載體，與熒光蛋白（GFP）融合表達,，注意避免移碼突變,。
2.然后將重組質(zhì)粒以及輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，可以用脂質(zhì)體法,，慢病毒配套細胞一般為293,。
3.收集慢病毒，濃縮,。
4.用慢病毒轉(zhuǎn)染原代細胞,。做好先做預(yù)實驗。
5.重組蛋白（例如,，GFP-actin）在細胞內(nèi)表達后,，自然的混入細胞骨架中，將之標(biāo)記綠色熒光,。
（一） 實驗流程（1和2為并列步驟）
1.慢病毒過表達質(zhì)粒載體的構(gòu)建
設(shè)計上下游特異性擴增引物,，同時引入酶切位點，PCR(采用高保真KOD酶,，3K內(nèi)突變率為0%)從模板中（CDNA質(zhì)?；蛘呶膸欤┱{(diào)取目的基因CDS區(qū)（coding sequence）連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下,，裝入慢病毒過表達質(zhì)粒載體,。
2.慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建
合成siRNA對應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)，退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體
3. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化
制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒,，三種質(zhì)粒載體分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提,，共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后6 h 更換為*培養(yǎng)基,，培養(yǎng)24和48h后,，分別收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒,。
(二) 實驗材料
2.1慢病毒載體,、包裝細胞和菌株
該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2,。其中質(zhì)粒上的ZsGreen1表達框能表達綠色熒光蛋白（GFP）,。
存在問題
首先，重組病毒的滴度還不夠高,，除Naldini等報道的結(jié)果外,，其余均在101TU/ml~103TU/ml之間,，難以達到體內(nèi)應(yīng)用的需要;
其次，由于HIV復(fù)雜的生物學(xué)性質(zhì),，要像常用的小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體那樣建立穩(wěn)定的HIV載體包裝細胞十分困難,，已建立的包裝細胞均不理想。
更為謹慎的做法是,，以非人類的慢病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建載體,，如猴免疫缺損病毒(SIV)、貓和牛免疫缺損病毒(FIV和BIV),、馬傳染性貧血病病毒等,，而這些工作尚屬空白。