關(guān)鍵詞:基因克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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基因克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
基因克隆技術(shù)包括把來自不同生物的基因同有自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA,，然后送入受體生物中去表達(dá),，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。因此基因克隆技術(shù)又稱為分子克隆,、基因的無性繁殖,、基因操作、重組DNA技術(shù)以及基因工程等,。
用重組DNA技術(shù),，將不同來源的DNA分子在體外進(jìn)行特異切割，重新連接,，組裝成一個(gè)新的雜合DNA分子,。在此基礎(chǔ)上，這個(gè)雜合分子能夠在一定的宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增,，形成大量的子代分子,，此過程叫基因克隆。
體外重組即體外將目的片斷和載體分子連接的過程,。大多數(shù)核酸限制性內(nèi)切酶能夠切割DNA分子形成有粘性末端,，用同一種酶或同尾酶切割適當(dāng)載體的多克隆位點(diǎn)便可獲得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火,，通過T4 DNA連接酶的作用便可形成重組體,，此為粘末端連接。當(dāng)目的DNA斷為平端,，可以直接與帶有平端載體相連,，此為平末端連接，但連接效率比粘端相連差些。有時(shí)為了不同的克隆目的,，如將平端DNA分子插入到帶有粘末端的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)表達(dá)時(shí),，則要將平端DNA分子通過一些修飾，如同聚物加尾,，加銜接物或人工接頭,，PCR法引入酶切位點(diǎn)等，可以獲得相應(yīng)的粘末端,，然后進(jìn)行連接,，此為修飾粘末端連接。
篩選方法如下：
（一）插入失活法
外源DNA段插入到位于篩選標(biāo)記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點(diǎn)后,，會(huì)造成標(biāo)記基因失活,，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化子相應(yīng)的抗生素抗性消失或轉(zhuǎn)化子顏色改變，通過這些可以初步鑒定出轉(zhuǎn)化子是重組子或非重組子,。目前常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍(lán)白篩選法,。
（二）PCR篩選和限制酶酶切法
提取轉(zhuǎn)化子中的重組DNA分子作模板，根據(jù)目的基因已知的兩端序列設(shè)計(jì)特異引物,，通過PCR技術(shù)篩選陽性克隆,。PCR法篩選出的陽性克隆，用限制性內(nèi)切酶酶切法進(jìn)一步鑒定插入片段的大小,。
（三）核酸分子雜交法
制備目的基因特異的核酸探針,，通過核酸分子雜交法從眾多的轉(zhuǎn)化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達(dá)蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因,。
（四）免疫學(xué)篩選法
獲得目的基因表達(dá)的蛋白抗體,，就可以采用免疫學(xué)篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達(dá)蛋白抗體,，也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達(dá)載體中獲得表達(dá)蛋白的抗體,。
基因工程的載體應(yīng)具有一些基本的性質(zhì)：1）在宿主細(xì)胞中有獨(dú)立的復(fù)制和表達(dá)的能力，這樣才能使外源重組的DNA段得以擴(kuò)增,。2）分子量盡可能小,，以利于在宿主細(xì)胞中有較多的拷貝，便于結(jié)合更大的外源DNA段,。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)操作中也不易被機(jī)械剪切而破壞,。3）載體分子中具有兩個(gè)以上的容易檢測(cè)的遺傳標(biāo)記（如抗藥性標(biāo)記基因），以賦予宿主細(xì)胞的不同表型特征（如對(duì)抗生素的抗性）,。4）載體本身具有盡可能多的限制酶單一切點(diǎn),，為避開外源DNA段中限制酶位點(diǎn)的干擾提供更大的選擇范圍。若載體上的單一酶切位點(diǎn)是位于檢測(cè)表型的標(biāo)記基因之內(nèi)可造成插入失活效應(yīng),，則更有利于重組子的篩選,。
DNA克隆常用的載體有：質(zhì)粒載體（plasmid）,，噬菌體載體（phage），柯斯質(zhì)粒載體（cosimid）,，單鏈DNA噬菌體載體（ssDNA phage ）,，噬粒載體（phagemid）及酵母人工染色體（YAC）等。從總體上講,，根據(jù)載體的使用目的，載體可以分為克隆載體,，表達(dá)載體,，測(cè)序載體，穿梭載體等,。
服務(wù)特點(diǎn)
1,、源于高質(zhì)量的cDNA文庫，外源片段插入?yún)^(qū)為全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本,。
2,、保證ORF區(qū)序列的準(zhǔn)確性。
3,、所有cDNA克隆的基因全為NCBI標(biāo)準(zhǔn),。
4、*,，工作周期短,。