關(guān)鍵詞:基因克隆實(shí)驗(yàn)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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基因克隆實(shí)驗(yàn)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
基因克隆技術(shù)包括把來(lái)自不同生物的基因同有自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接,，構(gòu)建成新的重組DNA,，然后送入受體生物中去表達(dá)，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合,。因此基因克隆技術(shù)又稱(chēng)為分子克隆,、基因的無(wú)性繁殖、基因操作,、重組DNA技術(shù)以及基因工程等,。
用重組DNA技術(shù)，將不同來(lái)源的DNA分子在體外進(jìn)行特異切割,，重新連接,，組裝成一個(gè)新的雜合DNA分子。在此基礎(chǔ)上,，這個(gè)雜合分子能夠在一定的宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增,，形成大量的子代分子，此過(guò)程叫基因克隆,。
篩選方法如下：
（一）插入失活法
外源DNA段插入到位于篩選標(biāo)記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點(diǎn)后,，會(huì)造成標(biāo)記基因失活，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化子相應(yīng)的抗生素抗性消失或轉(zhuǎn)化子顏色改變,，通過(guò)這些可以初步鑒定出轉(zhuǎn)化子是重組子或非重組子,。目前常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍(lán)白篩選法。
（二）PCR篩選和限制酶酶切法
提取轉(zhuǎn)化子中的重組DNA分子作模板,，根據(jù)目的基因已知的兩端序列設(shè)計(jì)特異引物,，通過(guò)PCR技術(shù)篩選陽(yáng)性克隆。PCR法篩選出的陽(yáng)性克隆,，用限制性?xún)?nèi)切酶酶切法進(jìn)一步鑒定插入片段的大小,。
（三）核酸分子雜交法
制備目的基因特異的核酸探針，通過(guò)核酸分子雜交法從眾多的轉(zhuǎn)化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達(dá)蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因,。
（四）免疫學(xué)篩選法
獲得目的基因表達(dá)的蛋白抗體,，就可以采用免疫學(xué)篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達(dá)蛋白抗體,，也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達(dá)載體中獲得表達(dá)蛋白的抗體,。
基因工程的載體應(yīng)具有一些基本的性質(zhì)：1）在宿主細(xì)胞中有獨(dú)立的復(fù)制和表達(dá)的能力，這樣才能使外源重組的DNA段得以擴(kuò)增,。2）分子量盡可能小,，以利于在宿主細(xì)胞中有較多的拷貝，便于結(jié)合更大的外源DNA段,。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)操作中也不易被機(jī)械剪切而破壞,。3）載體分子中具有兩個(gè)以上的容易檢測(cè)的遺傳標(biāo)記（如抗藥性標(biāo)記基因），以賦予宿主細(xì)胞的不同表型特征（如對(duì)抗生素的抗性）,。4）載體本身具有盡可能多的限制酶單一切點(diǎn),，為避開(kāi)外源DNA段中限制酶位點(diǎn)的干擾提供更大的選擇范圍。若載體上的單一酶切位點(diǎn)是位于檢測(cè)表型的標(biāo)記基因之內(nèi)可造成插入失活效應(yīng),，則更有利于重組子的篩選,。
DNA克隆常用的載體有：質(zhì)粒載體（plasmid），噬菌體載體（phage）,，柯斯質(zhì)粒載體（cosimid）,，單鏈DNA噬菌體載體（ssDNA phage ），噬粒載體（phagemid）及酵母人工染色體（YAC）等,。從總體上講,，根據(jù)載體的使用目的，載體可以分為克隆載體,，表達(dá)載體,，測(cè)序載體，穿梭載體等,。