關(guān)鍵詞:Southern Blot|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡(jiǎn)介：世界*品牌Southern Blot|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*。
Southern Blot|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧,，承諾客戶(hù)不成功不收費(fèi)。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時(shí),，我們也會(huì)提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗(yàn),。另一方面，我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信,，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶(hù)可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
一、 待測(cè)核酸樣品的制備
(一)制備待測(cè)DNA
基因組DNA是從動(dòng)物組織(或)細(xì)胞制備,。1.采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑裂解細(xì)胞,，或者用組織勻漿器研磨破碎組織中的細(xì)胞;2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA;3.用有機(jī)試劑(酚/氯仿)抽提方法去除蛋白質(zhì)。
(二) DNA限制酶消化
基因組DNA很長(zhǎng),，需要將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析,，通常用限制酶消化DNA。一般選擇一種限制酶來(lái)切割DNA分子,，但有時(shí)為了某些特殊的目的,，分別用不同的限制酶消化基因組DNA。切割DNA的條件可根據(jù)不同目的設(shè)定,，有時(shí)可采用部分和充分消化相結(jié)合的方法獲得一些具有交叉順序的DNA片段,。消化DNA后，加入EDTA,，65℃加熱滅活限制酶,樣品即可直接進(jìn)行電泳分離,，必要時(shí)可進(jìn)行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品后再進(jìn)行電泳分離,。
二,、 瓊脂糖凝膠電泳分離待測(cè)DNA樣品
(一)基本原理
Southern印跡雜交是先將DNA樣品(含不同大小的DNA片段)先按片段長(zhǎng)短進(jìn)行分離，然后進(jìn)行雜交,。這樣可確定雜交靶分子的大小,。因此，制備DNA樣品后需要進(jìn)行電泳分離,。在恒定電壓下,，將DNA樣品放在0.8~1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳可分辨70-80000bp的DNA片段,，故可對(duì)DNA片段進(jìn)行分離,。但需要用不同的膠濃度來(lái)分辨這個(gè)范圍內(nèi)的不同的DNA片段。原則是分辨大片段的DNA需要用濃度較低的膠,，分辨小片段的DNA則需要濃度較高的膠,。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間電泳后，DNA按分子量大小在凝膠中形成許多條帶,，大小相同的分子處于同一條帶位置,。另外為了便于測(cè)定待測(cè)DNA分子量的大小或是所處的分子大小范圍，往往同時(shí)在樣品鄰近的泳道中加入已知分子量的DNA樣品即標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA (DNA marker)進(jìn)行電泳,。DNA marker可以用放射性核素進(jìn)行末端標(biāo)記,，通過(guò)這種方式，雜交后的標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA也能顯影出條帶,。
(二) 基本步驟
1. 制備瓊脂糖凝膠,，盡可能薄,。DNA樣品與上樣緩沖液混勻，上樣,。推薦使用的靶基因的上樣量見(jiàn)不同條件下上樣本的使用指針比較表,。一般而言，對(duì)雜交系統(tǒng),，所需DNA樣品的濃度較低,，每道加2.5-5μg人類(lèi)基因組DNA;如果基因組比人類(lèi)DNA更復(fù)雜(如植物DNA)則上樣量可達(dá)10μg;每道上質(zhì)粒DNA<1ng。
2. 分子質(zhì)量標(biāo)志物(DIG標(biāo)記)上樣,。
3. 電泳,，使DNA條帶很好的分離。不同條件下上樣本的使用指針比較表
不同條件下上樣本的使用指針比較表
4. 評(píng)價(jià)靶DNA的質(zhì)量,。在電泳結(jié)束后,，0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min，紫外燈下觀察凝膠,。