關(guān)鍵詞:DNA合成服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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DNA合成服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
DNA復(fù)制的一般過程：
脫氧核糖核酸(DNA)是生物界遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ),。生物有機(jī)體的遺傳特征以密碼(code)的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序-即遺傳信息,，在細(xì)胞分裂前通過DNA的復(fù)制(Replication),，將遺傳信息由親代傳遞給子代，在后代的個(gè)體發(fā)育過程中,，遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄(Transcription)給RNA,，并指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，以執(zhí)行各種生命功能,，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀,，這種遺傳信息的傳遞方向，是從DNA到RNA再到蛋白質(zhì),，即所謂的生物學(xué)“中心法則",，80年代以后在某些致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)遺傳信息也可存在于RNA分子中，由RNA通過逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription)的方式將遺傳信息傳遞給DNA,。
DNA復(fù)制起始的關(guān)健步驟是前導(dǎo)鏈DNA的合成,，一旦前導(dǎo)鏈DNA的聚合作用開始，隨從鏈DNA的合成也隨著開始,。由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的,，所以它的起始相對(duì)簡(jiǎn)單，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進(jìn)行的,，所以引發(fā)階段比較復(fù)雜,。大腸桿菌的引發(fā)前體由Dna B. Dna C和單鏈結(jié)合蛋白組成。
(1)引物酶(primase)
它是一種特殊的RNA聚合酶,，可催化短片段RNA的合成,。這種短RNA片段一般十幾個(gè)至數(shù)十個(gè)核苷酸不等，它們?cè)贒NA復(fù)制起始處做為引物,。RNA引物的3′桹H末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子*個(gè)磷酸二酯鍵的位置,。
(2)引發(fā)體(primosome)
高度解鏈的模板DNA與多種蛋白質(zhì)因子形成的引發(fā)前體促進(jìn)引物酶結(jié)合上來(lái)，共同形成引發(fā)體,，引發(fā)體主要在DNA隨從鏈上開始,，它連續(xù)地與引物酶結(jié)合并解離，從而在不同部位引導(dǎo)引物酶催化合成RNA引物,，在引物RNA的3′桹H末端接下去合成DNA段,，這就是隨從鏈不連續(xù)合成的開始。
1.DNA聚合酶Ⅰ：
DNA polⅠ是由一條多肽鏈組成,，分子量為109KD,。酶分子中含有一個(gè)Zn++，是聚合活性必須的,。
大腸桿菌每個(gè)細(xì)胞中約有400個(gè)酶分子,，每個(gè)酶分子每分鐘在37℃下能催化667個(gè)核苷酸參入到DNA鏈中，用枯草桿菌蛋白酶可將此酶水介成兩個(gè)片段,，大片段分子量為76KD,，通常稱為klenow片段，小片段為34KD,。大小片段具有不同的酶活性,。
(1)DNA聚合酶的5′→3′聚合活性：
這是DNA聚合酶zui主要的活性，按模板DNA上的核苷酸順序,，將互補(bǔ)的dNTP逐個(gè)加到引物RNA3′桹H末端,，并促進(jìn)3′桹H與dNTP的5′桺O4形成磷酸二酯鍵，酶的專一性表現(xiàn)為新進(jìn)入的dNTP必須與模板DNA堿基配對(duì)時(shí)才有催化作用,，5′→3′聚合活性存在于klenow片段上,。
DNA聚合酶催化的DNA鏈延長(zhǎng)
(2)DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性：
這種酶活性的主要功能是從3′→5′方向識(shí)別并切除DNA生長(zhǎng)鏈末端與模板DNA不配對(duì)而游離的核苷酸，這種功能稱為校對(duì)功能,，這是保證其聚合作用的正確性*的,，因此對(duì)于DNA復(fù)制中*的保真性是至關(guān)重要的。
(3)DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性：
這種酶活性是從DNA鏈的5′端向3′末端水解已配對(duì)的核苷酸,，本質(zhì)是切斷磷酸二酯鍵,，每次能切除10個(gè)核苷酸,。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起重要作用,，對(duì)完成的DNA段去除5′端的RNA引物也是必須的,。
DNA polⅠ的5′→3′聚合活性和5′→3′外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA一條鏈上的切口從5′→3′方向移動(dòng),，這種反應(yīng)叫做缺刻平移(nick translation),，利用此反應(yīng)可在體外對(duì)DNA段進(jìn)行放射性磷(α-32PdNTP)的標(biāo)記制成探針(probe)，進(jìn)行核酸的分子雜交實(shí)驗(yàn),，是現(xiàn)代分子生物學(xué)的一項(xiàng)重要技術(shù),。