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樣本準備：血清樣本采集后,，需在 1000×g 的條件下離心 10 分鐘，小心分離出血清,；血漿樣本同樣按此離心條件處理,，注意要依據不同抗凝劑要求規(guī)范采集；細胞培養(yǎng)上清液則需以 1000×g 離心 10 分鐘,，去除其中的細胞碎片和其他不溶性雜質,。若樣本不立即使用，應分成小份,，在 - 20℃或 - 80℃環(huán)境下保存,，防止反復凍融，使用前需在室溫下緩慢充分解凍并確保均勻,。
試劑準備：從冰箱取出試劑盒后,，需將所有試劑在室溫下平衡 30 - 60 分鐘，使試劑溫度與室溫一致,，并充分混勻,。同時，依據實驗所需檢測的樣本數量,，確定酶標板的使用條數,，標準品孔和空白孔建議設置復孔，以提高檢測結果的準確性與可靠性,。此外,，要按照說明書要求，用蒸餾水將濃縮洗滌液準確稀釋成工作洗滌液,。
加樣：在酶標板上精確設置標準品孔,、空白孔與待測樣本孔。向標準品孔中加入 50μL 已稀釋好的不同濃度標準品,，濃度梯度需嚴格按照試劑盒說明書進行配置,；待測樣本孔加入 50μL 處理好的樣本；空白孔則不加任何試劑,。加樣時,，務必使用微量加樣器，并確保加樣量準確,，將樣本或標準品加于酶標板孔底部,，盡量避免觸及孔壁，加樣后輕輕振蕩酶標板,，使液體充分混勻,。
溫育與洗滌：加樣完成后，用封板膜將酶標板密封,，放置在 37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育相應時間,，具體溫育時長參照試劑盒說明書,。溫育結束后,，小心揭去封板膜,，甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液,，振蕩 30 - 60 秒后,，甩去洗滌液，并用吸水紙拍干,，此洗滌操作需重復 4 - 5 次,，以確保充分去除未結合物質。若使用洗板機進行洗滌,，需提前按照儀器操作規(guī)程進行設置,，且洗滌次數應適當增加 1 - 2 次。
后續(xù)反應與檢測：每孔加入 100μL HRP 標記的檢測抗體,，輕輕振蕩混勻,，再次用封板膜密封，37℃溫育 30 分鐘,。溫育結束后,，重復上述洗滌步驟。接著,，每孔依次加入底物 A,、B 各 50μL，輕輕振蕩混勻,，避免產生氣泡,，37℃避光顯色 15 - 20 分鐘。顯色反應結束后,，迅速向每孔加入 50μL 終止液,，加入終止液后應立即使用酶標儀在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。依據標準曲線,，計算出樣本中 MIP - 2 的濃度,，若樣本進行過稀釋，還需乘以相應的稀釋倍數得到實際濃度,。
試劑盒中的所有試劑在使用前必須充分平衡至室溫，避免因溫度差異影響檢測結果的準確性,。同時,，試劑使用后應及時放回冰箱冷藏保存，防止試劑變質,。
樣本采集,、處理過程務必嚴格遵循規(guī)范操作,，防止樣本受到污染或發(fā)生溶血、脂血等情況,，以免干擾檢測結果,。如血清樣本應避免溶血，紅細胞溶解時釋放出的具有過氧化物酶活性的物質,，可能會增加以 HRP 為標記的 ELISA 測定中的非特異性顯色,。
洗滌過程至關重要，既要確保充分去除雜質和未結合物質,，又要避免過度洗滌導致已結合的物質脫落,。洗滌液的配制應準確無誤，洗滌次數和時間需嚴格按照說明書執(zhí)行,。
加樣操作要精準,、迅速，盡量縮短各孔之間的加樣時間間隔,，保證實驗條件的一致性,。使用加樣器時，需定期校準,，確保加樣量的準確性,。
顯色反應過程需嚴格控制時間和溫度，避免光線直射,，以保證顯色效果的穩(wěn)定性,。加入終止液后，應盡快進行 OD 值測定,，一般建議在 15 分鐘以內完成,，防止結果出現偏差。
實驗過程中使用的所有耗材,，如酶標板,、吸頭、試管等,，應確保無污染且質量可靠,，避免對實驗結果造成影響。
若對檢測結果存在疑問或出現異常情況,，應及時檢查實驗操作過程,、試劑狀態(tài)以及儀器性能等，必要時可重復實驗進行驗證,。