接上篇有了這份秘籍,，您的液相色譜還會(huì)老出問(wèn)題嗎,？(一)
三、流動(dòng)相(MOBLLE PHASE)的問(wèn)題
甲醇和乙腈在高效液相色譜分析法中常常被用來(lái)配制流動(dòng)相,。高效液相色譜法中常用的試劑最好是高等級(jí)的專用試劑,，如色譜純?cè)噭Ｔ谝蟛惶珖?yán)格時(shí),，優(yōu)級(jí)純甚至分析純的試劑也能用,。高效液相色譜分析法中常用的是紫外檢測(cè)器，因此,，從降低基線噪音和提高分析靈敏度上來(lái)考慮,，應(yīng)該使用紫外吸收小且雜質(zhì)含量少的色譜純?cè)噭?/span>
1、流動(dòng)相的過(guò)濾
配制好的流動(dòng)相在使用前一定要先用0.5um孔徑的微孔濾膜來(lái)過(guò)濾,。這是因?yàn)槿芤褐泻泻芏嗳庋垭y以發(fā)現(xiàn)的微小顆粒,，如果不把它們?yōu)V除掉，就會(huì)堵塞泵口,、柱頭上的過(guò)濾器,，這樣就堵塞了流動(dòng)相的正常通道，使色譜柱的阻力增加,，柱壓升高,，柱效下降。碰到這種情況時(shí),，要換用經(jīng)過(guò)濾的流動(dòng)相,，并將堵塞的濾器拆下來(lái)浸泡在20%的硝酸水溶液中以超聲波清洗機(jī)清洗20分鐘，以除去濾片上的堵塞物,。
2,、流動(dòng)相的脫氣
流動(dòng)相在使用前必須脫氣，以盡可能的除去溶解在流動(dòng)相中的氣體,，否則,，這些氣體會(huì)使柱填料的性能降低，還能夠?qū)z測(cè)器的信號(hào)產(chǎn)生很大的干擾,。脫氣有多種方法,，如超聲脫氣、真空脫氣,、氮?dú)饷摎獾?。真空脫氣法和氮?dú)饬髅摎夥āＫ图状蓟旌虾髸?huì)產(chǎn)生大量的氣泡,，如果不脫氣就使用,，氣泡就會(huì)進(jìn)入色譜柱和檢測(cè)器，并將影響分析工作的正常進(jìn)行,。
四,、色譜柱的使用和保養(yǎng)
色譜柱是高效液相色譜儀最主要的部件，被測(cè)物質(zhì)能否被很好的分離和測(cè)定,，色譜柱的性能起著決定性的作用,。因此，在日常工作中,，應(yīng)特別注意色譜柱的正確使用和維修保養(yǎng),，以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。
1,、使用預(yù)柱和保護(hù)柱
預(yù)柱(pre-column)安裝于泵和進(jìn)樣器之間,，它給色譜柱中的流動(dòng)相提供了*的平衡，并防止了對(duì)柱填料有破壞作用的組分或污染物進(jìn)入色譜柱,。保護(hù)柱(guard column)可以阻擋能夠牢固地吸附于色譜柱上的組分進(jìn)入色譜柱,，保護(hù)柱應(yīng)與色譜柱的填料相同。預(yù)柱和保護(hù)柱可以經(jīng)常更換,，而不需要經(jīng)常更換色譜柱,，這就延長(zhǎng)了色譜柱的使用壽命。
2,、防止氣體進(jìn)入色譜柱
有些色譜柱(如凝膠柱)是不允許氣泡進(jìn)入的,，否則將會(huì)使柱效降低甚至形成微小的難以驅(qū)除的氣室。因此,，為了防止氣泡進(jìn)入色譜柱,，一定要使用經(jīng)過(guò)脫氣的流動(dòng)相,，并且要嚴(yán)格按照下列步驟來(lái)安裝色譜柱：
a.拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲，觀察是否有溶劑滲出,；
b.如有溶劑滲出,，即可將色譜柱接到管路上，以避免氣泡的進(jìn)入,；
c.如無(wú)溶劑滲出時(shí),，表明色譜柱的此端已經(jīng)進(jìn)去空氣了，此時(shí),，可將色譜柱的出口端接到進(jìn)樣閥上,，以流動(dòng)相來(lái)反方向沖洗色譜柱，以便將柱內(nèi)的空氣排除,。最好以0.2ml/min的小流量來(lái)沖色譜柱,，如果溶劑的流速太快或者是壓力突然的上升都將會(huì)導(dǎo)致柱性能的降低；
d.如果流出的溶劑里不含有氣泡,，說(shuō)明柱內(nèi)的氣體已經(jīng)被排出了,，再將色譜柱以正確的方向接好，這樣氣泡就進(jìn)不到色譜柱里面了,。
3,、色譜柱的清洗
為了不使被測(cè)物質(zhì)和雜質(zhì)停留在色譜柱中，在每次的樣品分析工作完成之后,，都應(yīng)及時(shí)地清洗色譜柱,。首先要用對(duì)被測(cè)樣品洗脫能力強(qiáng)的溶劑來(lái)洗脫色譜柱，以分析工作中常用的反相色譜分析法為例,，因其先流出的物質(zhì)是極性大的物質(zhì),，此時(shí)應(yīng)用100%的甲醇或使用異丙純、四氫呋喃等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內(nèi)的極性小的物質(zhì)洗脫下來(lái),，洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可,。如果流動(dòng)相是緩沖溶液，則應(yīng)先用蒸餾水來(lái)沖洗色譜柱,，以沖掉柱內(nèi)的鹽,，然后再用合適的溶劑來(lái)沖洗。
凝膠濾過(guò)色譜法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動(dòng)相,，用完之后當(dāng)然要用蒸餾水來(lái)沖洗,。如果是連續(xù)操作，可以將緩沖溶液置于柱內(nèi)過(guò)夜,，但最好是維持小流速(＜0.5ml/min)以防止緩沖鹽的析出,，如果流動(dòng)相中含有鹵化物，即使是停一夜，也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈,，以防止它們對(duì)柱體的腐蝕,。
4、色譜柱的存放
如果色譜柱暫時(shí)不用,，存放時(shí)要注意以下幾點(diǎn)：
a.幾天之內(nèi)的短期放置,，應(yīng)先用溶劑沖洗好色譜柱(如凝膠柱則用蒸餾水來(lái)沖洗),，再把色譜柱的兩頭用密封螺絲密封好即可,。
b.如果色譜柱長(zhǎng)期不用，僅用上述方法來(lái)處理就不行了,，這時(shí)應(yīng)使用色譜柱使用說(shuō)明書(shū)中所指明的溶劑來(lái)充滿色譜柱,，反相柱一般使用甲醇，正相柱則可用正已烷或庚烷,，而凝膠柱則不能用水了,，因柱內(nèi)如果有微生物的生長(zhǎng)則會(huì)使柱效降低，此時(shí)應(yīng)用0.05%的NaNs水溶液(防腐劑)來(lái)沖洗色譜柱,，再將色譜柱封嚴(yán),。色譜柱長(zhǎng)期放置時(shí)，一定要將色譜柱的兩端封嚴(yán),，以防止由于溶劑揮發(fā)而造成的柱填料干縮現(xiàn)象,，因這可導(dǎo)致柱效的嚴(yán)重降低。
c.色譜柱應(yīng)貯存在室溫下,，如果放置于0℃以下的環(huán)境里,，柱內(nèi)就會(huì)結(jié)冰，這也將導(dǎo)致柱效的降低,。
五,、色譜峰的雙峰問(wèn)題
長(zhǎng)期使用后的色譜柱，如果有雜質(zhì)進(jìn)入,，就會(huì)使色譜柱入口處的固定相“板結(jié)"并在流動(dòng)相所產(chǎn)生的高壓作用下,，形成柱頭的塌陷，被分析的樣品組分的正常色譜峰就變成了雙峰,，這時(shí)可按下述方法來(lái)修復(fù)色譜柱,。首先將柱頭的緊固螺母旋下，這時(shí)就會(huì)發(fā)現(xiàn)柱頭內(nèi)的固定相已被壓縮進(jìn)去了,，嚴(yán)重時(shí)可縮進(jìn)10mm以上,。在這種情況下，我們可用針尖將流動(dòng)相表層板結(jié)變黃的部分摳掉,，并以相同的固定相將此塌陷區(qū)填平,、壓實(shí)，再將色譜柱的緊固螺絲上緊，修復(fù)工作即告結(jié)束,。用經(jīng)過(guò)修復(fù)后的色譜柱再做樣品時(shí),，色譜峰就恢復(fù)正常了。
以上從幾個(gè)方面簡(jiǎn)介了色譜儀的正確使用及故障排除方法,。在日常工作中,，如果能對(duì)這些事項(xiàng)認(rèn)真對(duì)待，做到有問(wèn)題及時(shí)解決,，則會(huì)大大延長(zhǎng)儀器的正常使用期限,，并使儀器的性能得到最大限度的發(fā)揮。
