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ibidi活細胞共聚焦利器
閱讀：1251 發(fā)布時間：2023-8-28激光共聚焦顯微鏡可以觀察到細胞內(nèi)已經(jīng)標記好的蛋白質(zhì)和分子,，為生物學研究提供了更直觀的觀測方法。如今,，激光共聚焦成像已經(jīng)是一個非常常規(guī)的實驗操作,，廣泛應用于生物學各個研究領域中。
在細胞實驗中,，如果要進行一次激光共聚焦成像,，除了要知道相關的顯微鏡參數(shù)設置和操作以外，樣品的準備也是非常重要的一個環(huán)節(jié),。
由于激光共聚焦實驗對觀測耗材的底部有著比較高的要求,，普通的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)板或者培養(yǎng)瓶都不能直接用于激光共聚焦成像,。
1.比較常用的是使用170μm左右厚度的蓋玻片作為激光共聚焦成像的細胞載體,。但是使用蓋玻片，在實驗操作上是非常麻煩的,，如果買的是國產(chǎn)的蓋玻片,，首先要做的一步是將蓋玻片清洗并且烘干滅菌，才能開始使用,。
2.進口的細胞爬片，雖然不需要清洗,，但是還是需要進行包被才能讓細胞正常貼壁生長,。通常是將處理好爬片直接放在多孔板中，然后鋪細胞,，熒光染色后,，再用鑷子將爬片拿出，反過來放在滴有封片劑（甘油配置）的載玻片上,，再進行成像,。如圖1所示：
圖1：使用蓋玻片和細胞爬片的做免疫熒光方法示意圖
操作流程：
1.蓋玻片需用濃硫酸浸泡過夜，第二天用自來水沖洗20遍,，置于無水乙醇中6小時,，后用三蒸水沖洗3遍，再放在飯盒或玻璃培養(yǎng)皿中烘干，消毒,，再烘干后放入超凈臺備用,。
2.準備好的蓋玻片或者專業(yè)的細胞爬片需要根據(jù)細胞的貼壁情況使用多聚賴氨酸等蛋白包被。
3.培養(yǎng)板中放置爬片非常有技巧,，要將爬片與培養(yǎng)板底部緊密貼合,，這樣才能避免長成雙層細胞。
4.常規(guī)免疫熒光操作后,，取出爬片,。準備載玻片一張，在中間滴加適量的封片劑（甘油配置）,，將蓋玻片或爬片翻過來,，蓋在封片劑上，再用指甲油封片進行成像,。
5.在激光共聚焦成像之前,，盡量用熒光顯微鏡檢查一下細胞狀態(tài)和成像效果，再去做激光共聚焦,，畢竟做一次激光共聚焦的成像也不便宜的,。
ibidi無需爬片的簡便方法
這里要介紹ibidi的簡便方法，大大簡化了樣品準備流程,，需要用到專為共聚焦實驗設計的共聚焦培養(yǎng)皿,，這里以德國ibidi的共聚焦培養(yǎng)皿為例（ibidi 81156，ibiTreat底部處理）進行說明,。共聚焦培養(yǎng)皿的底部是polymer聚合物材質(zhì),，具有親水表面，讓大多數(shù)種類的細胞都可以直接貼壁,，無需另外進行包被,；同時，它們的底部符合蓋玻片標準——厚度僅為180μm,，在折射率,，阿貝系數(shù)上，它們的性能和標準爬片一致,，再加上極低的自發(fā)熒光和細胞可以直接貼壁的特性,，使它們成為共聚焦成像的專用培養(yǎng)皿。
所有的操作都在培養(yǎng)皿中進行,，不再需要鑷子以及繁瑣的清洗,，滅菌，包被程序（流程如圖2所示）
圖2：共聚焦專用培養(yǎng)皿的準備樣品流程,，可以直接進行細胞培養(yǎng)－染色－成像操作（圖中使用的產(chǎn)品為ibidi 81156共聚焦培養(yǎng)皿）
操作流程：
1.在超凈臺中打開無菌包裝的共聚焦專用培養(yǎng)皿,，取出培養(yǎng)皿,，加入細胞懸液，蓋上皿蓋,，放入培養(yǎng)箱中靜置,，等待細胞貼壁。常規(guī)細胞培養(yǎng),，待細胞長置合適密度再取出,，進行免疫熒光染色。
2.吸出培養(yǎng)基,，以PBS清洗細胞,，再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定細胞。
3.20分鐘后,，吸出固定液,，加入0.1%Triton X-100
4.10分鐘后，吸出Triton,，清洗細胞后加入BSA封閉,。
5.加入抗體熒光染色后，吸出所有試劑,，加入封片劑,，可以開始共聚焦顯微成像。
使用共聚焦培養(yǎng)皿還有個好處：往往一個共聚焦掃描成像持續(xù)時間很長,，培養(yǎng)皿中的液體非常容易揮發(fā),，共聚焦培養(yǎng)皿有皿蓋，可以減少揮發(fā),；如上述提到的ibidi共聚焦培養(yǎng)皿,，有個巧妙的鎖扣設計，可以扣緊培養(yǎng)皿,，確保在共聚焦成像的過程中,，皿中的液體不會揮發(fā)(如圖3）。
圖3：ibidi共聚焦培養(yǎng)皿的鎖扣設計
