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高通量組織研磨儀對真菌細胞的破壁及DNA提取
閱讀：2613 發(fā)布時間：2017-1-19實驗目的
對真菌細胞進行破壁,，提取其DNA。
實驗原理
隨著分子生物學技術(shù)的進展,，PCR相關方法越來越多地被應用到真菌學研究中來,，而真菌DNA的提取是包括分子診斷在內(nèi)的所有實驗的基礎，簡便快捷地提取真菌DNA,，且獲得的DNA完整,、純度高，對真菌分子生物學的研究有及其重要的意義,。
真菌細胞壁以幾丁質(zhì),、葡萄糖為主構(gòu)成細胞壁骨架，而基質(zhì)則由多糖,、甘露聚糖,、糖蛋白、脂質(zhì)等填充,。絲狀真菌堅韌厚壁的構(gòu)成,，需要較為繁瑣的破壁手段，故真菌DNA的提取較細菌或其他組織細胞難度更大,。為保證真菌PCR技術(shù)及其相關分子生物學技術(shù)的順利開展,，簡便快捷地提取真菌DNA，且獲得的DNA完整,、純度高,，是必須解決的前提條件。
實驗材料和器具
樣品：真菌類
儀器：高通量組織研磨儀（上海凈信,，Tissuelyser-48）
耗材：離心管（上海凈信,，0.4研磨單位）,，研磨珠（上海凈信,，6號，1顆）
試劑：TE Buffer,，DA Buffer,，E Binding Buffer，Elution Buffer
實驗步驟
方法1
1.1 取0.1g菌絲加入0.4研磨單位離心管中,，加0.08mlTE Buffer,，加入石英砂100mg；
1.2 將離心管放入上海凈信科技的高通量組織研磨儀Tissuelyser-48中,，設置頻率13單位振頻,，研磨10min；
1.3 取出離心管于65°C環(huán)境中溫浴30min，然后移出,；
1.4 加入0.65mlDA Buffer,，混合均勻后于冰浴中放置5min；
1.5 放入離心機14000r/min離心3min,；
1.6 將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的0.5研磨單位離心管中,，加0.15ml的E Binding Buffer，并混合均勻,，將混合液體轉(zhuǎn)移至Spin column,；
1.7 放入離心機6000r/min離心1min，棄去接液管中液體,；
1.8 Spin column中加入0.12ml的Wash Buffer,，于10000r/min離心30s，棄去接液管中液體,；
1.9 重復步驟1.8,，棄去接液管中液體后，再10000r/min離心60s,，Spin column轉(zhuǎn)到新的EP管中,；
1.10 Spin column中加入0.03ml Elution Buffer，室溫放置1min,。12000 r/min離心60s,，并棄去Spin column。
方法2
2.1 取0.1g菌絲加入0.4研磨單位離心管中,，加0.08ml10×TE Buffer,，加入石英砂100mg；
2.2 將離心管放入上海凈信科技的高通量組織研磨儀Tissuelyser-48中,，設置頻率60hz,，研磨2-3min；
2.3 加入0.024ml10%SDS,，加入0.002ml蛋白酶K,，混勻，65°C環(huán)境中水浴30min,；
2.4 然后渦旋1min,，加入0.024ml5M NaCl，加入1/10體積的10%CTAB（約0.013ml）,；2.5 于65°C水浴60min,，渦旋1min；
2.6 抽提,，加入1/2體積（約0.07mi）的Tris飽和酚及1/2體積（約0.07ml）的lvfang：異戊醇（24:1）,，混勻；
2.7 于離心機14000轉(zhuǎn)離心1min，取上清液到另一離心管中,；
2.8 重復步驟2.7 2-3次（視兩相界面雜質(zhì)多少而定）,。
2.9 加入等體積lvfang：異戊醇（24:1）混勻，14000轉(zhuǎn)離心10min,，取上清液至另一離心管中,；
2.10 zui后開始沉淀，加入0.045ml NH4Ac,，輕柔混勻,，冰水中放置30min，加入0.6倍體積的異丙醇,，混勻,，14000轉(zhuǎn)離心10min，棄上清液,；
2.11 用1000ul70%乙醇清洗沉淀,，室溫晾干，加0.04ml TE Buffer溶解沉淀,。
