SPOS技術(shù)：血細胞應(yīng)用

簡介：Accusizer780測試紅細胞和白細胞的粒徑分布和顆粒計數(shù)

傳統(tǒng)上,，紅細胞和白細胞的計數(shù)分布都是通過電阻法測試的。粒子分散在導(dǎo)電介質(zhì)中,，當粒子通過一個小孔時會導(dǎo)致電阻的增加,、電導(dǎo)率的下降,，電阻的響應(yīng)值與粒子大小和體積有關(guān)。雖然這項技術(shù)多年來應(yīng)用良好,，但本文可證明,，使用SPOS（單粒子光學(xué)傳感技術(shù)）結(jié)合自動稀釋的顆粒計數(shù)器可更容易地確定紅細胞和白細胞的粒徑大小，與電阻法相比,，可用的稀釋劑種類更多,，限制更小。

Accusizer780采用光阻法,，單粒子光學(xué)傳感技術(shù)(SPOS)的原理,，可同時測試粒徑分布和顆粒計數(shù)。傳感器內(nèi)部有一個激光,，單個粒子在經(jīng)過光感區(qū)域時,，對激光造成遮擋，從而導(dǎo)致光強度下降,，光強的減弱與粒子的橫截面積成比例,。Accusizer780配置有自動稀釋模塊，當樣品濃度過高,，導(dǎo)致多個粒子可能同時通過傳感器感應(yīng)區(qū)域(這個概率與顆粒濃度有關(guān)),，此時樣品會被自動稀釋。儀器可允許稀釋后的樣品在短時間間隔內(nèi)同時計數(shù)粒子（500,000#/min）,，而避免粒子間的重合效應(yīng),，這意味著粒子間不會相互遮擋，一次計數(shù)一個粒子,，得到真實的粒度分布和統(tǒng)計精度,。這其中僅需一條校準曲線即可將脈沖電壓轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的粒徑，不需要復(fù)雜的數(shù)學(xué)算法,。由于儀器具有自動稀釋的能力,，且一次計數(shù)一個粒子，因此可確定所有經(jīng)過傳感器的粒子都會被統(tǒng)計在內(nèi),，且不會造成重復(fù)計數(shù),。這種測試方式?jīng)Q定了儀器在粒徑分布上的高分辨率，尤其對于粒徑主體分布小于1um的樣品,，可觀測到尾端粒子的復(fù)雜分布情況,。如前所述，Accusizer780顆粒計數(shù)器不僅能得到樣品的粒徑分布,，還能做到顆粒計數(shù),。

本文采用配有自動稀釋功能的Accusizer780進行實驗，用來測試一種新儀器的效率，該儀器可將血細胞的主要成分進行分離,。在大多數(shù)醫(yī)院,，血細胞都是用電阻法進行顆粒計數(shù)分析。電阻顆粒計數(shù)器由兩個電極,，電解質(zhì)鹽溶液,，一個帶有小孔的非導(dǎo)電玻璃罩組成，電荷可從一個電極流向另一個電極,。血液樣品注入樣品池的一端后,，由于玻璃小孔一端的壓力差不同，液體會流經(jīng)小孔,，從而導(dǎo)致電極間的電荷流動,，相應(yīng)的電流會發(fā)生變化，或維持電流不變,，電壓增加,，電壓或電流的響應(yīng)值與樣品池的排除體積成比例。通過這種方法,，可確定血細胞的粒徑分布和顆粒濃度,。

電阻法有以下缺陷：① 電阻法要求樣品懸浮在高導(dǎo)電率的分散劑中，這大大增加了操作成本,；② 玻璃小孔很容易堵塞,；③ 小孔的規(guī)格很小,，會限制樣品的流經(jīng)速度,，從而限制粒子的計數(shù)速率，以上這些因素都限制了電阻法測試血細胞的粒度分布和計數(shù)的使用,。Accusizer780則沒有以上問題存在,，該技術(shù)基于光阻法的原理，任何合適的稀釋劑都可使用,。這一點對于血細胞分離裝置很重要,，因為它需要多種不同的緩沖液來實現(xiàn)不同程度的分離，而其他離子的存在會對分離產(chǎn)生不利影響,。Accusizer780的樣品流動池與紅細胞和白細胞(凝塊及其他大的凝聚物)的大小相比,，流動池的尺寸很大，因此很少發(fā)生堵塞,。重要的是,，儀器的稀釋速度可高達120ml/min，對于來自分離器的高濃度血液成分,，可做到快速的自動稀釋以及顆粒計數(shù),。

該實驗測試的樣品為血細胞，范圍從紅細胞居多的成分到白細胞居多的成分，總共分析了六個組分,，命名從4到9,。在“AN160”文獻中，通過對樣品4的zeta電位的檢測可確定,，樣品4中幾乎是紅細胞,，而5~9號樣品則分別含有越來越多的白細胞。

圖1顯示了Accusizer780測試不同樣品的粒徑分布圖：

 圖1：不同組分的血液樣品疊加圖

除4號樣品外,，其他樣品的粒徑分布均由兩個窄峰組成,。首峰的粒徑在8.5um左右，是紅細胞的粒徑大小,，第二個峰粒徑分布在11-12um左右,，與白細胞的粒徑大小匹配，所以可識別紅細胞（首峰）和白細胞（第二個峰）的粒度分布及濃度占比,。需注意的是,，在圖1中，第二個峰的濃度分布在樣品4中幾乎為0,，但后續(xù)幾個樣品中數(shù)目越來越大,。首先，這說明樣品4實際上是紅細胞,，其次這一數(shù)據(jù)還表明,，其他樣品中的白細胞組分變得更加豐富。圖2繪制了白細胞與紅細胞的體積和計數(shù)的比率圖,。

圖2：a. 紅細胞與白細胞的體積占比圖  b. 紅細胞與白細胞的數(shù)目占比圖

圖2a為峰2與峰1的體積占比,，圖2b為峰2與峰1的數(shù)目占比，這些數(shù)據(jù)可表明血液分離裝置將紅細胞和白細胞分離的程度大小,。值得一提的是,，樣品4中的紅細胞與白細胞的數(shù)目占比約為500:1（圖中顯示為0.002），但樣品5-9中,，占比在逐漸增加（樣品9的比率接近0.3,，約是正常值的100倍），這進一步說明了分離裝置的效率,。這一數(shù)據(jù)還表明,，Accusizer780可以用于定量測量樣品中紅血球和白細胞的相對數(shù)量。

若使用電阻法測試白細胞數(shù)量,，則在測試前須先溶解（破壞）紅細胞,，因為紅細胞的數(shù)量往往會使白細胞的計數(shù)變得更困難及不。*,，溶解會對紅細胞和白細胞造成影響,，使得紅細胞幾乎被破壞，而白細胞的細胞膜則被剝?nèi)ゲF聚在一起，形成不同的顆粒,。圖3測試了樣品6在溶解后的粒度分布,，在6-7um處出現(xiàn)一個單峰，且顆粒數(shù)目大大減少,。根據(jù)我們已知的化學(xué)溶解效應(yīng),，圖3中的分布粒徑是白細胞溶解后的殘留，而實際存在的第二個窄峰在溶解后就消失了,。

綜上所述,，本文提供的數(shù)據(jù)表明，SPOS可以同時測試紅血球和白細胞的粒徑分布和顆粒濃度,。此外,，還可配置自動稀釋模塊對樣品進行自動稀釋，用這種方法可在不溶解紅細胞的前提下,，對紅細胞和白細胞進行定量分析,。研究表明，溶解會破壞紅細胞,，但只會將白細胞的粒徑大小從12um降低到6.5um左右,。