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超低溫保存法之病毒處理
大多數(shù)微生物可用超低溫保存,，超低溫保存法是適用范圍廣的微生物保存法,。需要復(fù)雜營養(yǎng)的微生物種，如用其他的貯存方法不能保持其活力（如植物的病原性真菌）,，通?？捎贸蜏氐姆椒ū４妫ˋTCC 1983；Halliday,，Baker 1985）,。此法是將凍存在小管或安瓿里的細(xì)胞以較慢的冷凍速率（1℃／分鐘）冷凍，直至—150℃,，再將這些小管貯存在—150～－196℃的液氮中,。
超低溫的冷凍保護劑不同于凍干法所用的冷凍劑。ATCC 常用一種由甘油（10％）,、二甲亞砜（5％）和培養(yǎng)液制成的混合劑保存多數(shù)的細(xì)胞株,。這些化學(xué)試劑進入細(xì)胞內(nèi)可避免內(nèi)膜的冷凍損傷,。 貯存在低溫容器內(nèi)的細(xì)胞復(fù)蘇時必須小心操作。當(dāng)小管被加熱時,，所形成的冰晶會將細(xì)胞殺死,，正確操作就可避免這種事故。只要迅速將樣品解凍就能減少活力的丟失,，做法是：將封口的小管迅速放入37℃的水中,，直至所有的冰融化，然后打開管口,，將內(nèi)容物移入培養(yǎng)基,。
超低溫保藏的微生物必須始終貯存在溫度非常低的環(huán)境中，因此需要液氮罐,。在長期貯存的過程中必須經(jīng)常注意補充液氮,。這種貯存方式比凍干法需要更多的經(jīng)費，包括為了維持貯存溫度所必要的勞動力和液氮等,。
2.2 材料
病毒超低溫保存所需材料有：熱收縮塑料管（Nunc Cryoflex）,，液氮罐，防護手套和面罩,，久性記號筆,，氣體噴燈，裝液氮的保溫瓶,。
2.3 方法
（1）剪一段兩端各超出冷凍管長度2cm 的熱收縮塑料管,。
（2）將含有澄清病毒懸液（組織培養(yǎng)的上清培養(yǎng)基，或組織培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞溶解產(chǎn)物均可）冰浴幾分鐘,，用滅菌移液管將0.2ml 冰浴過的上清懸液分裝到冷凍管內(nèi),，并將蓋子擰緊。
（3）將有病毒的冷凍管放入熱收縮塑料管中部,，插入正確的標(biāo)簽,。
（4）用噴燈小心加熱熱收縮塑料管，并使之包住冷凍管,。注意不要用太高的溫度加熱熱收縮塑料管,。
（5）再小心加熱熱收縮塑料管的兩端，用大號鑷子夾緊管的端口至*密封,。
（6）將密封好的冷凍管快速在裝有液氮的保溫瓶中冷凍（操作時要求戴面罩和手套）,。
（7）將冷凍過的冷凍管放入液氮罐中的格子內(nèi)，同時記錄樣品的詳細(xì)的存放位置,、實驗編號和存放日期等,。
（8）需要用時，迅速從液氮罐內(nèi)取出所需樣品,，并投入37℃水浴箱中解凍后,，用解剖刀片在冷凍管的硅化墊圈處切開熱收縮塑料管,。擰開冷凍管的蓋子時不需要除去熱收縮塑料管。