英文名稱：In Situ Cell Death Detection Kit, POD
產(chǎn)品應(yīng)用：借助光學(xué)顯微鏡定性檢測(cè)單細(xì)胞水平細(xì)胞凋亡
中國(guó)俗稱：原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒  中國(guó)簡(jiǎn)稱：  凋亡細(xì)胞檢測(cè)試劑盒
注冊(cè)品牌：Roche  生產(chǎn)廠家：  Roche公司
訂購(gòu)貨號(hào)：11684817910
規(guī)格型號(hào)：50 Tests
保存溫度：-15～-25℃
產(chǎn)品種類：細(xì)胞凋亡檢測(cè)
到貨時(shí)間：1～5 天
英文名稱：In Situ Cell Death Detection Kit, POD
中文名稱：原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒, POD

檢測(cè)原理：原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒基于對(duì)細(xì)胞凋亡早期發(fā)生的單鏈和雙鏈DNA斷裂的檢測(cè),。凋亡細(xì)胞被固定和滲透。隨后,，這些細(xì)胞和TUNEL反應(yīng)混合物（包含TdT和熒光素-dUTP）一起孵育,。孵育期間，TdT催化熒光素-dUTP標(biāo)記的游離3’-OH添加到單鏈和雙鏈DNA中,。清洗后,，標(biāo)記物包含在DNA斷裂位點(diǎn)處，并被抗熒光素抗體結(jié)合物識(shí)別標(biāo)記（報(bào)告酶過氧化物酶）,。清洗去除未結(jié)合的酶配體,，POD保留在免疫復(fù)合物中，可通過底物反應(yīng)觀察到,。

樣本材料：細(xì)胞離心涂片器和細(xì)胞涂片制備,，載玻片上生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞，冷凍和蠟包被的組織切片

產(chǎn)品特點(diǎn)：
靈敏：zui大凋亡細(xì)胞標(biāo)記強(qiáng)度（細(xì)胞染色）,，比缺口平移要高
快速：熒光素-dUTP標(biāo)記使其在TUNEL反應(yīng)結(jié)束后直接可進(jìn)行樣本分析（2-3 h）
方便：使用熒光素d-UTP直接標(biāo)記法可在檢測(cè)時(shí)確認(rèn)TUNEL反應(yīng)效率
準(zhǔn)確：可在分子水平（DNA鏈斷裂）鑒定極早期凋亡細(xì)胞
靈活：不包含底物,；可選擇不同染色方法

產(chǎn)品成份：
• 酶溶液（TdT）
• 標(biāo)記溶液（熒光素-dUTP）
• 媒介物POD（抗-熒光素抗體-POD），即開可用

訂購(gòu)信息：
› 11684795910 In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein, 50 Tests
› 11684809910 In Situ Cell Death Detection Kit, AP, 50 Tests
› 11684817910 In Situ Cell Death Detection Kit, POD, 50 Tests

In Situ Cell Death Detection Kit, POD
11684817910
1 kit for up to 50 tests

    Sensitive: The maximum intensity of labeling (cell staining) of apoptotic cells is higher than the nick translation method
    Fast: The use of fluorescein-dUTP allows analysis of the samples directly after the TUNEL reaction, but before the addition of the secondary detection system
    Convenient: The direct labeling procedure using fluorescein-dUTP allows verification of the efficiency of the TUNEL reaction during the assay procedure
    Accurate: Identification of apoptosis at a molecular level (DNA-strand breaks) and identification of cells at the very early stages of apoptosis
    Flexible: No substrate included; provides the opportunity to select the staining procedure of choice

產(chǎn)品名稱： 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒POD法
英文名稱：In Situ Cell Death POD
產(chǎn)品貨號(hào)： 11684817910
細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒POD法

                                  
產(chǎn)品編號(hào)     品名/ Packsize的
11684817910  

在原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,，過氧化物酶
1包（高達(dá)50測(cè)試）

優(yōu)點(diǎn)

    敏感：細(xì)胞凋亡（細(xì)胞染色）標(biāo)簽的zui大強(qiáng)度高于缺口翻譯方法
    快速：使用熒光的dUTP允許后直接TUNEL反應(yīng),，但在此之前的二次檢測(cè)系統(tǒng)除了對(duì)樣品的分析
    方便：直接標(biāo)記程序，使用熒光素-dUTP標(biāo)記允許在檢測(cè)過程中的TUNEL反應(yīng)效率的核查
    準(zhǔn)確：在分子水平（DNA鏈斷裂）和細(xì)胞凋亡的早期階段的細(xì)胞識(shí)別凋亡鑒定
    靈活：無基板;提供了選擇的機(jī)會(huì),，選擇染色過程

 
產(chǎn)品描述

樣品材料：細(xì)胞離心涂片和細(xì)胞涂片準(zhǔn)備,，在幻燈片上生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞，冷凍和石蠟包埋的組織切片,。
 
背景資料

廣泛使用的方法,，以確定細(xì)胞凋亡的基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳和DNA段分析基于分析3 H -胸苷，另外,，5 -溴-2'-脫氧尿苷,。該方法涉及從零散,，低分子量的DNA不分段，高分子量的DNA分離在一個(gè)特定的細(xì)胞群,。因此,，這些方法并不在一個(gè)特定的細(xì)胞群提供單個(gè)細(xì)胞的命運(yùn)的信息，特別是在組織切片,。另外,，個(gè)別細(xì)胞凋亡可能顯微鏡確認(rèn)，因?yàn)楹巳旧|(zhì)凝聚和碎裂的外觀特征,，但這種方法是主觀的,，不限于一個(gè)相對(duì)狹窄的時(shí)間窗口時(shí)的形態(tài)學(xué)變化zui大的是細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)是DNA降解，這是有選擇性的DNA鏈接的internucleosomal地區(qū)處于早期階段,?？赡墚a(chǎn)生DNA斷裂雙鏈和單鏈DNA斷裂（尼克斯）。兩種類型的休息可以自由3'-OH末端修飾核苷酸標(biāo)記（例如在酶催化反應(yīng),，生物素-dUTP標(biāo)記,，地高辛-dUTP標(biāo)記，熒光的dUTP）檢測(cè),。末端轉(zhuǎn)移酶（TDT）催化脫氧模板獨(dú)立聚合單和雙鏈DNA的3'-末端,。這種方法也被稱為TUNEL法（牛逼 ð ü DT-介導(dǎo)的TP-X的列印 ICK é ND 升abeling）。另外,，自由3'-OH基團(tuán),，可使用DNA聚合酶標(biāo)記通過名為尼克翻譯的模板依賴的機(jī)制。然而,，TUNEL法被認(rèn)為是更敏感和更快捷,。

roche 11684817910中文操作說明書
一、 原理：

TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況,。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下,，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP,，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合,，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞,，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞,；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘-OH形成,，很少能夠被染色,。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè),。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià),，以及通過雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段,。

二、 器材與試劑

器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng),、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）,、塑料蓋玻片或封口膜,、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等,；

試劑：試劑盒含TdT 10×,、熒光素標(biāo)記的dUTP 1×、標(biāo)記熒光素抗體的HRP,；自備試劑：PBS,、雙蒸水、二甲苯,、梯度乙醇（100,、95、90,、80,、70%）、DAB工作液（臨用前配制,，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）,、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或細(xì)胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate,，臨用前配制）,、蘇木素或甲基綠、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl,，pH 7.5,， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等,。

三,、 實(shí)驗(yàn)步驟

操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟、水合→細(xì)胞通透→加TUNEL反應(yīng)液→加converter-POD→與底物DAB反應(yīng)顯色→光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)并拍照,。

具體操作步驟（石蠟包埋切片的檢測(cè)）：

1. 用二甲苯浸洗2次,，每次5min；

2. 用梯度乙醇（100,、95,、90、80,、70%）各浸洗1次,，每次3min,；

注：上面兩步是針對(duì)石蠟切片樣本的處理

4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C（溫度、時(shí)間,、濃度均需摸索）或者加細(xì)胞通透液8min,；

5. PBS漂洗2次；

6. 制備TUNEL反應(yīng)混合液,，處理組用50μl TdT+450μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻,；而陰性對(duì)照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽(yáng)性對(duì)照組先加入100μl DNase 1,，反應(yīng)在15~25℃×10min,，后面步驟同處理組。

7. 玻片干后,，加50μl TUNEL反應(yīng)混合液（陰性對(duì)照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液）于標(biāo)本上,，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×1h。

8. PBS漂洗3次,；

9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光波長(zhǎng)為450~500nm,，檢測(cè)波長(zhǎng)為515~565nm）；

10. 玻片干后加50μl converter-POD于標(biāo)本上,，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×30min,。

11. PBS漂洗3次；

12. 在組織處加50~100μlDAB底物,，反應(yīng)15~25℃×10min,；

13. PBS漂洗3次；

14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染,，幾秒后立即用自來水沖洗,。梯度酒精脫水、二甲苯透明,、中性樹膠封片,。

15. 加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計(jì)200~500個(gè)細(xì)胞）并拍照,?？山Y(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來綜合判斷（未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,，晚期出現(xiàn)凋亡小體,，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓,、脫落,；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解,，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）

對(duì)于.培養(yǎng)細(xì)胞的預(yù)處理：
①在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸（見備注4）,，干燥后在去離子水中漂洗，干燥后4℃保存,；
②適當(dāng)方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,，同時(shí)設(shè)未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照組，各組離心收集約1×106個(gè)細(xì)胞,，PBS洗一次,，重懸，加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上,，自然干燥，使細(xì)胞很好的吸附到載玻片上,；
③將吸附細(xì)胞的載玻片在4%多聚甲醛（見備注2）中固定25min,；
④PBS浸洗二次，每次5min,；
⑤將吸附細(xì)胞的載玻片在0.2%的Triton X-100（見備注5）中處理5min,；
⑥PBS浸洗二次，每次5min,；

后續(xù)操作如同石蠟包埋切片的6—15

四,、 注意事項(xiàng)

1. 進(jìn)行PBS 清洗時(shí)，每次清洗5 min,。

2. PBS清洗后,，為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行，請(qǐng)盡量除去PBS 溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng),。

3. 在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反應(yīng)液后,，請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進(jìn)行,，這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體,，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗(yàn)失敗。

4. TUNEL反應(yīng)液臨用前配制,，短時(shí)間在冰上保存,。不宜長(zhǎng)期保存，長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)酶活性的失活,。

5. 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色,，則不可使用，需重新配制,。

6. 用甲基綠（Methyl Green）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色后,，請(qǐng)用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進(jìn)行洗凈（100%乙醇）,、脫水（二甲苯）透明,、封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察操作,。如果此時(shí)使用80~90%的乙醇洗凈時(shí)，甲基綠比較容易脫色,，注意快速進(jìn)行脫水操作,。

7. 熒光素標(biāo)記的dUTP液含甲次酸鹽和二氯鈷等致癌物，可通過吸入,、口服等途徑進(jìn)入機(jī)體,，注意防護(hù)。

8. 試劑保存,；未打開的試劑盒貯存在-20℃（-15~25℃）,；converter -POD液一旦解凍，以后就保存在4℃（2~8℃）下,，至少在6 m內(nèi)穩(wěn)定,，避免再次凍存；TUNEL反應(yīng)液臨用前配好后,，放至冰上直至使用,。

9. 結(jié)果分析時(shí)注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DNA斷，從而引起假陽(yáng)性結(jié)果,；而有些類型的凋亡性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不*,，以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進(jìn)入胞內(nèi)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果,。